成團泛菌苯丙氨酸氨基變位酶的熱穩定性改造

劉輝，張葦苗，徐建，周麗*，周哲敏*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

來源于成團泛菌(Pantoeaagglomerans)的苯丙氨酸氨基變位酶(phenylalanine aminomutase,PaPAM)可催化α-苯丙氨酸轉化為(S)-β-苯丙氨酸[1-2]，(S)-β-苯丙氨酸是合成抗生素andrimid[2]的重要組成物質之一，具有較高的經濟價值。然而野生型的PaPAM熱穩定性較差，酶活也較低，尤其是當溫度超過50 ℃,酶活力顯著下降，處理1 h后剩余酶活只有30%左右，酶活低也是限制其生產應用的一個障礙，因此現階段還不能滿足大規模加工工藝需求，其工業應用受到限制[3-4]。

苯丙氨酸氨基變位酶(phenylalanine aminomutase，PAM，EC: 5.4.3.10)是MIO(4-methylideneimidazole-5-one)家族酶成員之一，MIO是一種新的內源性輔因子，經過翻譯后修飾系統將氨基酸側鏈基團轉化而成的[5-6]。目前認為MIO依賴性酶的轉氨機制是Friedel-Crafts[7-9]，經兩步反應：第一步反應，MIO進攻底物的苯環，使苯環瞬間喪失芳香性，形成帶正電荷的中間體，活化α位的質子，苯丙氨酸脫去氨基，形成不飽和酸(反式肉桂酸)，MIO形成MIO-NH2中間復合物；第二步反應，中間復合物氨基和氫質子交給反式肉桂酸的不飽和雙鍵的β位，形成β-苯丙氨酸，完成催化過程。因此，如果反應在催化完第一步后就結束了，體現的是苯丙氨酸裂解酶活性；如果完成這兩步催化反應，則體現的是苯丙氨酸氨基變位酶活性。在MIO依賴型酶中，酶活中心上方覆蓋的loop環的柔性大小對酶學性質起著重要的作用[10]。例如，BARTSCH等[11]將T.chinensis來源的PAM(TcPAM)酶活中心上覆蓋的loop環柔性增大，loop的靈活性提高，酶活中心構象不穩定會導致肉桂酸中間體從酶活中心釋放出來，增大了loop環的柔性，成功將氨基變位酶的活性變成氨基裂解酶的活性。反之，降低這些loop環的柔性、提高其穩定性，反應產生的中間體就不易從酶活中心釋放出去，有利于上述兩步反應中的第二步反應進行[12]，有利于提高苯丙氨酸氨基變位酶的活性以及熱穩定性。同時，催化產生(R)-β-苯丙氨酸的TcPAM，其酶活以及熱穩定性都優于PaPAM，所以將PaPAM的氨基酸序列突變為TcPAM上的相應氨基酸，有望改進PaPAM的催化性質。

此外，多項研究表明[13-14]，定點突變改造酶分子氨基酸組成，可有效提高酶的熱穩定性。WU[15]將T.chinensis來源PAM的319 位帶負電荷的谷氨酸突變成不帶電荷的甲硫氨酸，獲得突變酶PaPAM-Q319M，酶的區域選擇性發生改變，氨基偏向添加在底物不飽和雙鍵的β位。NAIK等[16]發現以下的氨基酸置換可能改變酶的熱穩定性，比如帶正電荷極性氨基酸之間的置換(賴氨酸Lys置換精氨酸Arg)、極性氨基酸置換非極性氨基酸(絲氨酸Ser置換丙氨酸Ala)以及極性氨基酸之間的置換(甘氨酸Gly置換丙氨酸Ala)。在酶的α-螺旋結構中，酶分子表面的丙氨酸與甘氨酸互換可導致疏水作用的增加，進而有可能導致酶分子穩定性的提高。另一種情況下，KHURANA[17]將酶分子表面的疏水氨基酸變為親水氨基酸，提高了脂肪酶的穩定性。JAOUADI[14]通過優化絲氨酸蛋白酶表面電荷與電荷之間的相互作用提高了其熱穩定性。

本文嘗試改變P.agglomerans來源PAM酶活中心上方loop環上的氨基酸及與其相互作用位點氨基酸，分別突變為不同類型的氨基酸，降低loop環的柔性，以期穩定酶活中心的結構，提高酶的熱穩定性及酶活。本研究為苯丙氨酸氨基變位酶的進一步應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒以及培養基

實驗室保藏的EscherichiacoliJM109以及E.coliBL21(DE3)菌株分別用于重組質粒的構建和基因表達。化學合成P.agglomerans來源的苯丙氨酸氨基變位酶的基因序列，并克隆到表達載體pET-28a的限制性酶切位點EcoR I和Hind III之間，得到重組質粒pET-28a-PAM。

LB培養基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10,加入抗生素(卡那霉素)的質量濃度為50 μg/mL。

1.2 材料與儀器

α-苯丙氨酸、β-苯丙氨酸，Sigma公司；蛋白純化鎳柱、蛋白純化儀器，AKTA公司；高效液相色譜，日立公司;PCR儀器，BIO-RAD公司;多功能酶標儀，Bioteck公司;pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因操作

以質粒pET-28a-PAM為模板，采用定點突變(重疊延伸)方法突變野生PaPAM基因。相關引物如表1所示。PCR得到的基因產物用DpnI酶消化以降解質粒模板，然后轉化至E.coliJM109感受態細胞中。重組質粒經基因測序驗證正確后，轉化至E.coliBL 21(DE3)中構建PAM突變體表達菌株。

1.3.2PaPAM酶的表達

挑取重組菌株單菌落接種于含5 mL質量濃度為50 μg/mL的卡那霉素LB培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養10 h。將上述種子液培養物按體積分數為1%的接種量接種于含卡那霉素質量濃度50 μg/mL的LB培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養至菌液OD600值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，20 ℃誘導培養16～20 h。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

1.3.3 重組蛋白的純化和鑒定

離心收集培養后的重組菌體，按濃縮5倍體積比例重懸于蛋白結合緩沖溶液(50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超聲破碎細胞，12000 r/min離心50 min，上清用0.22 μm濾膜過濾，獲得粗酶液。用10 倍柱體積的結合緩沖溶液平衡5 mL的His Trap HF柱，取20 mL破碎上清液上樣，用10倍柱體積的結合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白質，用8倍柱體積的500 mmol/L咪唑緩沖液線性洗脫蛋白質，收集樣品后用透析袋密封，置于1/15 mol/L Na2HPO4和KH2PO4緩沖液(pH 8.5) 中4 ℃透析過夜，去除殘余咪唑，獲得純酶。用SDS-PAGE方法[18]分析鑒定粗酶液和純化后蛋白的純度。

1.3.4 蛋白濃度的測定

蛋白質含量采用常規的Bradford法[19]測定。

1.3.5 酶活的測定

野生型酶和突變體純酶在使用前調成相同的蛋白濃度。在1/15 mol/L Na2HPO4和KH2PO4緩沖液(pH 8.5)中加入200 μL 20 mmol/L α-苯丙氨酸為底物、再加入100 μg純酶，反應終體積為0.5 mL，50 ℃下反應30 min，100 ℃滅活20 min。酶活力單位定義為：在50 ℃、pH 8.5、底物終濃度為8 mmol/L時，30 min內將1 μmol α-苯丙氨酸轉化為1 μmol β-苯丙氨酸所需的酶量。

1.3.6 最適溫度的測定

分別在30、40、50、60、70 ℃下測定酶的活性，將最高的酶活力定義為100%，繪制得相對酶活隨溫度變化曲線。

1.3.7 熱穩定性的測定

在50 ℃分別保溫30、60、90、120 min，以及在60 ℃條件下分別保溫10、20、30 min，測定殘留酶活性。定義保溫0 min所測得的酶活為100%，繪制得相對殘留酶活隨溫度變化曲線。

1.3.8 最適pH值的測定

在不同pH值的緩沖液中測定野生型酶和突變體酶的活性，定義最高酶活力值為100%，繪制得相對酶活隨pH值變化曲線。其中pH 7.0～9.0緩沖液為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 9.0～11.0緩沖液為50 mmol/L Na2CO3緩沖液。

1.3.9 動力學常數的測定

以濃度范圍為1～20 mmol/L α-苯丙氨酸為底物，在50℃下反應30 min，測量β-苯丙氨酸的生成反應速率，通過軟件GraphPad Prism 5擬合得到Km與Vmax值，然后再根據Kcat=Vmax/ [Enzyme]求得Kcat及催化效率常數Kcat/Km。

1.3.10 底物和產物的測定

底物反應后經0.22 μm有機濾膜過濾，用高效液相色譜檢測。檢測器為紫外檢測(波長為210 nm)，色譜柱為Diamonsil 5 μm C18(2)250 mm×4.6 mm，流動相為V(0.1%甲酸溶液)∶V(乙腈)=9∶1，檢測時間為25 min，柱溫為40 ℃，流速為0.5 mL/min，進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1 突變位點的選擇

對不同來源PAM一級序列進行比對，獲得了PaPAM的非保守氨基酸位點(圖1)。

T.chinensis來源PAM的78位、92位、93位氨基酸對酶活中心上方loop環的柔性影響較大[11]，本研究將P.agglomerans來源PAM的三級晶體結構與其進行比對(圖2)，發現2種來源酶的酶活中心結構高度相似，PaPAM上對應位點分別為76位、90位、91位(圖3-a)，且都為非保守位點。此外，選取PaPAM酶活中心上方其他loop環、且非保守位點73位、95位、439位、462位和455位進行突變(圖3-b)。上述位點分別突變為不同類型的氨基酸，包括中性非極性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、帶正電荷極性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)和中性極性氨基酸(天冬酰胺、蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸)、帶負電荷極性氨基酸(谷氨酸)。突變點在三級結構中分布如圖3所示。

a-P. agglomerans;b-T. chinensis;c-底物圖2 P.agglomerans與T.chinensis來源的PAM三級晶體結構比對Fig.2 Third order crystal structure comparison of P.agglomerans and T. chinensis

a-對比結果位置;b-loop兩端位置圖3 突變位點在苯丙氨酸氨基變位酶三維結構中的分布Fig.3 The distribution of mutants in PAM three-dimensional structure注：數字所示為突變位點

2.2 單點突變的結果初步篩選

突變體純酶液分別測定酶活，結果如圖4-a所示。所有突變點中，A95R、I91M突變體的酶活比原酶有顯著提高。439位的丙氨酸、455位苯丙氨酸和462位的甘氨酸距離酶活中心較近，經過突變后酶分子失活。

突變體純酶液于50 ℃處理60 min后，測定剩余酶活，以分析其熱穩定性。如圖4-b所示，野生型PaPAM經過處理后僅剩余30%酶活，而多個突變體熱穩定性明顯提高，其中，突變體I91M、A95R的熱穩定性明顯提高，剩余酶活分別達到了83%、43%。如圖4-c所示，60 ℃處理20 min后，野生型PaPAM經過處理后僅剩余40%酶活，而多個突變體熱穩定性明顯提高，其中，突變體I91M剩余酶活達到了88%。

a-酶活篩選；b-50 ℃穩定性篩選; c-60 ℃穩定性篩選圖4 突變體初步篩選結果Fig.4 Preliminary screening of single mutants

突變體I91M, A95R熱穩定性提高，可能是由于穩定了酶活中心所覆蓋的loop穩定性，導致結構變得更加穩定。因此，文本選擇酶活提高的A95R和熱穩定性顯著提高的I91M突變體進行后續實驗。

2.3 突變體酶學性質表征

將野生型PaPAM以及突變體I91M、A95R進行酶學表征。如圖5-a所示，野生型PaPAM和A95R突變體的最適溫度為50 ℃，而突變體I91M的最適反應溫度提高到55 ℃；如圖5-b，突變體的最適pH并未發生偏移。

a-最適溫度曲線；b-最適pH曲線圖5 最適反應條件的測定Fig.5 Determination of the optimum reaction conditions

如圖6所示，2個突變體的熱穩定性明顯提高，其中I91M在50 ℃保溫60 min可殘留83%酶活，而野生型PaPAM僅殘余30%酶活。I91M突變體在50 ℃下的半衰期提高為107.59 min(表2)，比野生型酶PaPAM(50 ℃下的半衰期僅為26 min)提高了4倍。

2.4 動力學常數的測定

為了研究催化活性，測定了突變體酶的動力學常數(如表3)。2種突變體Km值均大于野生型PaPAM，說明與底物的親和能力減弱，可能原因是酶活中心的氨基酸突變影響了酶活中心與底物結合的周圍環境所致。然而，突變體的Kcat均比野生型PaPAM提高了2倍以上，可能原因是穩定的酶活中心構象更有利于氨基變位的第二步反應進行[11]。

圖6 熱穩定性的測定原始酶與突變體的熱穩定性(在50 ℃下殘余酶活隨時間變化)Fig.6 Determination of the thermal stability of wild-type PAM and mutants were determined by monitoring residual activities over time (0 to 120 min) at 50 ℃

酶半衰期/minPaPAM26.65±0.59I91M107.59±0.88A95R46.65±0.14

表3 野生型酶與突變體酶的動力學參數以及比酶活Table 3 Kinetic parameters and specific activities of wild-type PAM and mutants

另外，I91M的穩定性提高較多，但是Kcat值卻不如A95R突變體高，原因可能是突變后的甲硫氨酸與底物氨基酸的苯環形成穩定的S/Π作用導致穩定性增加[12]，酶活不高的原因可能是甲硫氨酸的硫原子同時參與形成配位鍵，增強了底物羧酸鹽結合口袋[15]，不利于底物與酶活中心附近氨基酸的質子傳遞。

3 討論

本文通過基因定點突變構建重組的苯丙氨酸氨基變位酶突變體，通過篩選得到催化活性和熱穩定性都顯著提高的突變體I91M、A95R。其中I91M的熱穩定性提高明顯，50 ℃保溫1 h，剩余酶活由野生型酶的30%左右提高至83%左右，并且其酶活比原始酶略有提高。

目前，在MIO依賴型酶中，催化因子Tyr所在的柔性區Tyr-loop對酶學性質起著相當重要的作用[10]。張帆[20]通過改變loop的柔性成功使苯丙氨酸氨基裂解酶的最適pH發生偏移，更適應酸性環境，并對治療苯丙酮尿癥(phenylketonurics, PKU)具有實際應用。

本文探究苯丙氨酸氨基變位酶催化中心上所覆蓋的2個柔性loop環的穩定性對酶性質的作用，通過篩選loop環上的突變體，改善了酶的穩定性。該方法可作為一種改善酶穩定性的有效策略，為其他酶的改造提供參考。相信基于對蛋白酶三級結構的分析，在未來可以解析更多的蛋白酶催化機制，發現更多的應用。