黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物群落的動態變化

高慶超，常應九，馬蓉，曹效海, 2，王樹林, 2*

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016) 2(青海大學 省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧，810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)屬于茄科枸杞屬，主要分布于我國西北等地，其富含多種營養成分和活性成分，且具有多種生物活性，如抗氧化、抗疲勞、預防癌癥、抗心血管疾病等[1-2]，充分利用黑果枸杞及其藥用價值開發新的食品及藥品，對人類健康具有重要意義。

酵素是以乳酸菌、酵母菌等多菌種復合發酵果蔬、菌菇及中草藥等，形成富含礦物質、維生素、多種酶、有機酸和少量乙醇等產物的液態或固態食品[3]。酵素舊稱為“酶”，但不只是酶，它還包含產酶微生物和相互調節因子及其相互作用的產物，強調的是微生態整體[4-5]。酵素中主要微生物為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，其發酵過程是復雜的間歇性過程[6]，TEOH等[7]從紅茶菌酵素分離出接合酵母。盧夢瑤等[8]以10種酵素為菌源，經分離純化、產酸定性和定量試驗及16S rDNA水平鑒定，獲得1株高產醋酸菌為芝庇儂醋酸桿菌。MARISA等[9]從諾麗酵素中分離出歐文氏菌和葡萄糖桿菌。

傳統微生物分離方法是在微生物發酵食品領域中一種最常用的研究方法，但其得到的微生物信息較片面，有很大的局限性，而近年來，由于高通量測序技術具備靈敏度高、讀數長和效率高的特點，能更加真實地反映發酵食品中微生物群落定性及相對定量的遺傳信息[10-11]，已廣泛應用于發酵食品微生物體系研究。

本研究以黑果枸杞酵素為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對不同發酵階段的酵素中的主要微生物群落構成及動態變化進行研究，為揭示黑果枸杞酵素發酵中微生物群落結構變化和相互作用關系提供依據，以期能夠實現發酵過程中微生物菌群的調控，為黑果枸杞酵素的開發提供理論參考。

1 試驗材料與方法

1.1 主要試驗材料及儀器

黑果枸杞、枸杞、瑪卡、蕨麻、沙棘粉等，青海千平萬安農業科技有限公司提供。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA)；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒(Life)；2×TaqMaster Mix(Vazyme)；MagicPure Size Selection DNA Beads(Transgen)等。

Pico-21臺式離心機，Thermo Fisher；凝膠成像系統，美國UVP；Qubit?3.0熒光計，Invitrogen；PCR儀，BIO-RAD；DYCP-31DN DNA電泳槽，北京六一儀器廠；混勻型干式恒溫器，深圳拓能達科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑果枸杞酵素制作

稱取黑果枸杞300 g、枸杞200 g、蕨麻125 g、瑪卡75 g、紅糖125 g、沙棘粉25 g、無菌水2 L，瑪卡和蕨麻清洗后水煮60 min至變軟，黑果枸杞和枸杞清洗后按質量比1∶3加無菌水進行復水，將全部原料打漿，轉至滅菌壇中攪勻，密封并做相應標記，置于28 ℃培養箱下避光發酵，每10 d平行取樣3次，并編號為0、10、20、30、40、50和60 d，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.2 理化及活性成分的測定

可滴定酸按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進行測定[12]。總糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[13]，以葡萄糖為標準品，測得標準曲線為y=7.235 6x-0.012(R2=0.990 6)。花青素含量測定采用pH示差法[14]。總酚含量測定采用福林酚法[15]，以沒食子酸為標準品，測得標準曲線為y=0.101 4x+0.044 4(R2=0.999 4)。SOD酶活力按照SOD試劑盒中的方法進行測定。同時委托青海譜測檢測有限公司對黑果枸杞酵素中大腸桿菌和沙門氏菌的含量進行測定。

1.2.3 高通量測序

將第0、10、20、30、40、50和60天取的樣品委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因組DNA提取、PCR擴增、凝膠電泳、上機測序及數據分析。將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類后，根據97%相似性將序列分成不同的操作單元(operational taxonomic units, OTU)，并進行生物信息統計分析。

1.2.3.1 DNA提取

分別取第0、10、20、30、40、50、60天樣品，采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取細菌基因組DNA和真菌基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

1.2.3.2 PCR擴增

以341F(5’- CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)/805(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)為引物擴增細菌16S rDNA V3-V4區序列；以ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)/ITS2R(5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)為引物擴增真菌ITS rDNA ITS1-2區序列。第一輪擴增：擴增體系： 2×Taqmaster Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，加H2O 30 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5 個循環，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20 個循環，72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。第二輪擴增：引入Illumina橋式PCR兼容引物，擴增體系： 2×Taqmaster Mix 15 μL，Primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，PCR產物(上一輪) 20 ng，加H2O 30 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5 個循環，72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。擴增產物用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增出目的條帶，并對DNA進行純化回收。

1.2.4 數據處理與分析

利用Excel 2007、R軟件、SPSS Statistics 20.0等進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞酵素中理化及活性成分測定結果

發酵前后黑果枸杞酵素中理化及活性成分測定結果如表1所示。

表1 黑果枸杞酵素發酵前后理化及活性成分含量變化Table 1 The changes of physicochemical and active ingredient contents of enzymes includingLycium Ruthenicum Murr. before and after fermentation

注：“-”表示未測。

由表1可以看出，黑果枸杞在60 d時，相關理化及活性成分發生了變化，可滴定酸含量增加了290.81%，總糖含量降低了62.91%，總酚含量增加了80.42%，SOD酶活力上升了5.90%。花青素保留率為42.49%，由于酵素中酸含量上升，花青素在酸性條件下會在一定程度上延緩花青素的降解且致病菌(大腸桿菌和沙門氏菌)未超標。從這些指標中可以看出，黑果枸杞酵素在發酵60 d后，除花青素有所損失，其他指標都呈現較好的水平，因此，可以判定黑果枸杞酵素在發酵60 d后擁有較高的質量水平。

2.2 黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物群落的Alpha多樣性分析

Shannon指數和Simpson指數表示樣品中微生物的多樣性，Shannon值越大，Simpson值越小，說明群落多樣性越高；ACE指數和Chao指數是用來估計物種總數，即群落的豐富度；Coverage指數表示各樣本文庫的覆蓋率[16]。

2.2.1 黑果枸杞酵素自然發酵過程中細菌群落的Alpha多樣性分析

對不同發酵階段的黑果枸杞酵素的細菌群落進行多樣性分析，結果見表2。

表2 黑果枸杞酵素自然發酵過程中細菌群落的Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of bacterial community during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr.

由表2可知， 0、10、20 d樣品中細菌群落的多樣性相對較高，30、40 d樣品中細菌群落的多樣性相對較低；0、20 d樣品中細菌群落的豐富度相對較高，40、50 d樣品中細菌群落的豐富度相對較低。結果表明，黑果枸杞酵素在發酵0～20 d中細菌群落多樣性和豐富度相對較高。

2.2.2 黑果枸杞酵素自然發酵過程中真菌群落的Alpha多樣性分析

對不同發酵階段的黑果枸杞酵素的真菌群落進行多樣性分析，結果見表3。

表3 黑果枸杞酵素自然發酵過程中真菌群落的Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of fungal community during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr.

由表3可知，30、40、50 d樣品中真菌群落的多樣性相對較高，0、60 d樣品中真菌群落的多樣性相對較低；30、40、50 d樣品中真菌群落的豐富度相對較高，10、20 d樣品中真菌群落的豐富度相對較低；結果表明黑果枸杞酵素在發酵30～50 d中真菌群落多樣性和豐富度相對較高。

2.3 黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物群落結構組成分析

2.3.1 黑果枸杞酵素自然發酵過程中細菌群落結構組成分析

對不同發酵階段黑果枸杞酵素中細菌群落結構進行門和屬水平上的分析，結果見圖1和圖2。

圖1 黑果枸杞酵素自然發酵過程中細菌門水平分布圖Fig.1 The histogram of bacteria during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in phylum

由圖1可知，在門水平上，共檢測出26種已知的細菌門，其中，0 d樣品中主要為變形菌門(Proteobacteria)，所占比例約為99%。在10、20、30、40、50、60 d樣品中主要為厚壁菌門(Firmicutes)，所占比例96.9%～99.1%。

圖2 黑果枸杞酵素自然發酵過程中細菌屬水平分布圖Fig.2 The histogram of bacteria during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in genus

由圖2可知，在屬水平上，共檢測出48種已知的細菌屬。在0 d樣品中主要為泛菌屬(Pantoea)71.35%、假單胞菌屬(Pseudomonas)14%、歐文氏菌屬(Erwinia)6.61%。在10 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)57.92%、乳球菌屬(Lactococcus)14.23%、魏斯氏菌屬(Weissella)12.08%、腸球菌屬(Enterococcus)9.45%、片球菌屬(Pediococcus)4.41%。在20 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)77.28%、腸球菌屬(Enterococcus)19.39%。在30 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.26%、腸球菌屬(Enterococcus)2.78%。在40 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.8%、腸球菌屬(Enterococcus)2.18%。在50 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)96.8%、腸球菌屬(Enterococcus)2.18%。在60 d樣品中主要為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)95.1%、乳球菌屬(Lactococcus)1.82%、片球菌屬(Pediococcus)1.77%。以上結果說明未經發酵的原料汁中細菌主要為泛菌屬(Pantoea)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，在發酵第10 天時，酵素中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和腸球菌屬(Enterococcus)含量增加，在發酵第20天時，酵素中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)含量增加，說明在發酵0～20 d時，酵素中細菌群落的豐富度與多樣性相對較高，這也與Alpha多樣性指數分析中結果一致。在發酵第30、40、50、60天時，酵素中細菌種類趨于穩定，主要優勢菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。

2.3.2 黑果枸杞酵素自然發酵過程中真菌群落結構組成分析

對不同發酵階段黑果枸杞酵素中真菌群落結構進行門和屬水平上的分析，結果見圖3和圖4。

由圖3可知，在門水平上，共檢測出11種已知的真菌門，且相比于酵素中的細菌變化趨于穩定，真菌變化更為復雜。在0 d樣品中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)49.75%，擔子菌門(Basidiomycota)3.86%，無法歸類的菌類占45.99%，說明在未經發酵前，原料中菌類非常復雜。在10 d樣品中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)67.68%，擔子菌門(Basidiomycota)18.16%，無法分類的菌類占12.54%；在20 d樣品中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)84.22%，擔子菌門(Basidiomycota)14.34%；在30 d樣品中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)57.61%，擔子菌門(Basidiomycota)38.04%；在40 d樣品中真菌主要為擔子菌門(Basidiomycota)56.1%，子囊菌門(Ascomycota)32.53%，無法歸類的真菌5.35%；在50 d樣品中真菌主要為擔子菌門(Basidiomycota)39.37%，子囊菌門(Ascomycota)37.03%，被孢霉菌門(Mortierellomycota)3.22%，無法歸類的真菌10.83%，無法分類的菌類占8.84%；在60 d樣品中真菌主要為子囊菌門(Ascomycota)93.73%，擔子菌門(Basidiomycota)4.85%。

圖3 黑果枸杞酵素自然發酵過程中真菌門水平分布圖Fig.3 The histogram of fungi during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in phylum

圖4 黑果枸杞酵素自然發酵過程中真菌屬水平分布圖Fig.4 The histogram of fungi during natural fermentation of enzymes including Lycium Ruthenicum Murr. in genus

由圖4可知，在屬水平上，共檢測出32種已知的真菌屬。在0 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)25.52%，鐮刀菌屬(Fusarium)9.25%，球腔菌屬(Mycosphaerella)6.62%，枝孢霉屬(Cladosporium)3.02%，無法歸類的菌類占45.99%；在10 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)18.84%，曲霉菌屬(Aspergillus)16.33%，黑粉菌屬(Filobasidium)11.44%，球腔菌屬(Mycosphaerella)8.53%，青霉菌屬(Penicillium)7.21%，鐮刀菌屬(Fusarium)3.7%，無法分類的菌類占12.54%；在20 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)38.97%，球腔菌屬(Mycosphaerella)20.58%，枝孢霉屬(Cladosporium)10.74%，Filobasidium8.87%，鐮刀菌屬(Fusarium)5.36%；在30 d樣品中真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)17.6%，Filobasidium16.3%，Membranomyces11.17%，球腔菌屬(Mycosphaerella)10.32%，枝孢霉屬(Cladosporium)5.96%，青霉菌屬(Penicillium)5.77%，鐮刀菌屬(Fusarium)5.51%；在40 d樣品中真菌主要為鎖瑚菌屬(Membranomyces)34.42%，黑粉菌屬(Filobasidium)7.82%，絲蓋傘屬(Inocybe)6.12%，鏈格孢屬(Alternaria)6.07%，球腔菌屬(Mycosphaerella)4.3%，鐮刀菌屬(Fusarium)3.4%，枝孢霉屬(Cladosporium)2.76%；在50 d樣品中真菌主要為Membranomyces23.59%，Inocybe5.86%，擬青霉屬(Simplicillium)3.82%，被孢霉屬(Mortierella)3.22%，鐮刀菌屬(Fusarium)2.59%，青霉菌屬(Penicillium)1.93%，無法歸類的真菌10.83%，無法分類的菌類占8.84%；在60 d樣品中真菌主要為酵母屬(Saccharomyces)89.83%，黑粉菌屬(Filobasidium)1.79%，鎖瑚菌屬(Membranomyces)1.61%，球腔菌屬(Mycosphaerella)1.11%。在發酵過程中其主要作用的是鏈格孢屬(Alternaria)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、黑粉菌屬(Filobasidium)、鎖瑚菌屬(Membranomyces)、酵母屬(Saccharomyces)等，在發酵60 d后，主要真菌為酵母屬(Saccharomyces)，且經分析主要為啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.4 黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物群落豐度熱圖分析

采用群落Heatmap圖分析微生物物種和不同發酵階段樣品之間的交互關系，見圖5和圖6。

由圖5可知，在細菌屬水平上，30 d和40 d樣品最為相似，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品細菌結構差異明顯，在0 d樣品中，泛菌屬(Pantoea)為優勢菌屬；在10、20、30、40、50、60 d樣品中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為優勢菌屬。

由圖6可知，在真菌屬水平上，10、20與30 d樣品較相似，40與50 d樣品較相似，60 d樣品與其他樣品組之間真菌結構差異明顯。在0 d樣品中，無法歸類的菌類較多，真菌的種類較復雜，其次為鏈格孢屬(Alternaria)；在10、20與30 d樣品中，主要為鏈格孢屬(Alternaria)，球腔菌屬(Mycosphaerella)，Filobasidium，枝孢霉屬(Cladosporium)，青霉菌屬(Penicillium)，說明在發酵第10～30天，這幾類真菌起主要作用，且動態變化此消彼長。在40 d與50 d樣品中，真菌群落多樣性和豐富度相對較高，鎖瑚菌屬(Membranomyces)為主要優勢真菌屬。在60 d樣品中，真菌群落多樣性和豐富度最低，酵母屬(Saccharomyces)為優勢真菌屬。

圖5 細菌屬水平豐度熱圖Fig.5 The heatmap of bacteria in genus

2.5 黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物的主成分分析

對不同發酵階段的黑果枸杞酵素中細菌和真菌在屬水平上進行主成分分析，結果見圖7和圖8。

由圖7可知，主成分1表示所有變量的88 %，主成分2表示所有變量的10%，總計貢獻率達98 %。從PCA2方向看，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品差異明顯，從PCA1方向看，0，10，20 d與30、40、50、60 d樣品差異明顯，說明PCA1是導致樣本間差異的主要因素。30、40、50、60 d樣品在PCA1與PCA2方向距離較近，相對聚集，說明此發酵階段，樣品最為相似。

圖6 真菌屬水平豐度熱圖Fig.6 The heatmap of fungi in genus

圖7 細菌屬水平主成分分析Fig.7 The principal component analysis of bacteria in genus

圖8 真菌屬水平主成分分析Fig.8 The principal component analysis of fungi in genus

由圖8可知，主成分1表示所有變量的46%，主成分2表示所有變量的31%，總計貢獻率達77%。從PCA1方向看，0 d樣品與10、20、30、40、50、60 d樣品差異明顯，從PCA2方向看，各樣品間距離分布差異明顯，說明PCA2是導致樣本間差異的主要因素。

3 討論

有研究表明，在酵素中主要微生物為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，但有些酵素由于原料不同，可能不會有醋酸菌的大量生長繁殖[17-18]。通過高通量測序分析黑果枸杞酵素自然發酵過程中微生物的動態變化，樣品中未檢測到醋酸菌，而是酵母菌、乳酸菌和霉菌在發酵期間起主要作用，這也與OKADA等[19]研究結果一致。

由圖2和圖5可知，在未發酵前主要為泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)，但在發酵后，這3種菌屬含量急劇減少，可能與發酵過程中產酸、碳源和氮源消耗較快、pH變化等有關[20]。在發酵中后期，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)起主要作用，成為優勢菌屬，且腸球菌屬(Enterococcus)也占有一定比例，可能與其耐酸性強和發酵碳水化合物廣泛等有關，也有可能是由于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)具有的胞外多糖和分泌的細菌素保護了自身生長繁殖，抑制或破壞了雜菌生長[21]。

由表3和圖4可知，真菌動態變化在酵素發酵過程中更為復雜，在發酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對較高。發酵前期和中期真菌多樣性和豐富度相對較高，隨著發酵時間延長，代謝產物增多，微生物之間競爭愈發激烈，一些在酵素體系中適應能力相對較弱的真菌被淘汰[22]，適應能力強的真菌在后期發揮主要作用，在發酵60 d后，主要優勢真菌屬為酵母屬(Saccharomyces)，且經分析主要為啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

由于酵素近年來的火熱程度，目前，國內外對于酵素中代謝產物的變化分析相對較多[23-25]，而關于采用高通量測序技術對酵素發酵過程中微生物的動態變化進行的研究報道相對較少。基于Illumina MiSeq高通量測序技術對不同發酵階段的黑果枸杞酵素微生物的群落組成及多樣性進行分析，將為今后黑果枸杞酵素產品開發中菌種的調控提供理論依據，具有重大意義。

4 結論

黑果枸杞酵素在發酵0～20 d細菌群落多樣性和豐富度相對較高，在發酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對較高。在未發酵前，主要細菌為泛菌屬(Pantoea)，而真菌的種類較為復雜，無法歸類的真菌較多，已知真菌中鏈格孢屬(Alternaria)占比較大。在自然發酵過程中主要優勢細菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，主要優勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。在發酵60 d后，主要細菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，主要真菌為酵母屬(Saccharomyces)。研究成果揭示了黑果枸杞酵素發酵中微生物群落結構的變化，為發酵過程中微生物菌群的調控提供了方向，以期能開發出高附加值的黑果枸杞功能性食品。