蕎麥皮多糖組成及其抗氧化特性分析

劉瑤，王新然，趙悅，李林強

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安,710119)

多糖是由多個單糖分子脫水縮合形成的高分子碳水化合物，是構成動植物細胞壁的主要成分[1]。現有研究表明多糖能夠增強免疫、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗病毒、抗炎、抗氧化等[2-4]。其中關于抗氧化的研究較多，一直是多糖功能的研究熱點。在正常情況下，機體內的氧化系統和抗氧化系統處于動態平衡的狀態，自由基的產生和清除也處于動態平衡，但當這個2平衡被打破之后，機體會產生過量自由基，對自身造成損傷，添加外源性抗氧化劑可以清除自由基達到抗氧化的目的，但人工合成的抗氧化劑存在著潛在危險，而多糖可作為一種天然的抗氧化劑替代合成的抗氧化劑[5-6]。

蕎麥屬于蓼科，是中國傳統保健食品之一，常用來做饸饹、涼粉、面包、糕點等食品，以預防高血脂、高血糖、高血壓等。蕎麥多糖是其主要功能成分之一，國內對其研究較多。李飛等[7]優化了蕎麥多糖的提取工藝；谷仿麗等[8]研究表明適當劑量的金蕎麥多糖可增強免疫；WU等[9]研究表明蕎麥多糖能有效促進白血病細胞的分化和成熟；賴云等[10]報道了蕎麥多糖能夠抑制小鼠自發性活動并延長其睡眠時間；曾靖等[11]報道了蕎麥多糖對肝有保護作用；較多研究表明蕎麥多糖具有抗氧化作用[12-13]，而抗氧化又與多糖的組成和結構有關[4]。

蕎麥皮是蕎麥粉加工副產品，目前對蕎麥皮的研究多集中于酚類[14]、膳食纖維[15]、色素[16]等的研究，蕎麥皮多糖的研究鮮有報道，蕎麥皮多糖是否具有與蕎麥粉多糖相似的保健功能還不明確。本研究以蕎麥皮為研究對象，對蕎麥皮多糖進行分離和提取，通過對其組成成分及抗氧化特性的分析，為蕎麥皮多糖的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥皮，當地農貿市場。DPPH、甲醇，美國Sigma公司；乙腈，德國Merck公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，阿拉伯糖，上海源葉生物科技有限公司；DEAE-52纖維素、苯酚、乙醇、H2SO4、NaOH、氯仿、正丁醇、TFA、鐵氰化鉀、三氯乙酸、過氧化氫、鄰苯三酚等，均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌恒溫槽(HXC-500-6A)，北京惠誠佳儀科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀(vertex 70)，Bruker公司；光學顯微鏡(TYPE120M)，Motic公司；高效液相色譜儀，Thermo公司；C18柱(250 mm×4.6 mm)，Agilent；紫外可見分光光度計，上海儀電分析有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥皮多糖的提取及粗多糖提取率的測定

多糖的制備：將蕎麥皮粉碎，以料液比1∶10(g∶mL)在50、60、70、80、90 ℃磁力攪拌恒溫水槽中分別處理2 h，過濾棄渣，400×g離心10 min，合并上清液。減壓濃縮后，采用Sevage法[17]脫蛋白，取上清液加入乙醇，在4 ℃條件下過夜，離心后棄上清液，真空冷凍干燥后，得到蕎麥皮粗多糖。稱取粗多糖100 mg溶于2 mL蒸餾水中，采用DEAE-52 纖維素柱層析分離法，依次用蒸餾水、0.5、1.0 mol/L NaCl進行洗脫，收集洗脫液、透析、真空冷凍干燥，得到純度較高的蕎麥皮多糖，備用。

蕎麥皮粗多糖含量=蕎麥皮中總糖含量-其還原糖含量[18]，其中蕎麥皮總糖含量的測定采用苯酚硫酸法[19]，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(y=1.460 7x+0.360 4，R2=0.951)。分別吸取經50、60、70、80、90 ℃處理后的蕎麥皮提取液1.0 mL，測定吸光度，根據標準曲線方程計算總糖含量，同時測定此蕎麥皮提取液中還原糖的含量(采用1.3.2中方法)，蕎麥皮粗多糖提取率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Y,蕎麥皮粗多糖提取率，%；A,蕎麥皮總糖含量，mg；B,還原糖含量，mL；M,蕎麥皮質量，mg

1.3.2 蕎麥皮提取液中還原糖含量的測定

還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸法。參考文獻[20]的方法，做部分修改。分別取葡萄糖標準溶液(1 mg/mL) 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mL于試管中，用蒸餾水定容至0.5 mL，加0.5 mL DNS試劑混勻，在沸水浴中加熱5 min，冷卻至室溫，再加入蒸餾水8 mL，混勻，于520 nm波長處測定各待測液的吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg)，吸光度為縱坐標繪制標準曲線(y=1.668 9x+0.033，R2=0.995)。分別吸取經50、60、70、80、90 ℃處理后的蕎麥皮提取液0.5 mL于試管中，測定吸光值。通過標準曲線計算蕎麥皮提取液中還原糖的含量，并計算出其所占總糖含量的百分比。

1.3.3 蕎麥皮多糖的紅外光譜分析

取KBr于110 ℃烘箱中干燥2 h，將干燥后的KBr與經不同溫度提取后的蕎麥皮多糖分別以100∶1的比例研磨混合，在壓片機中壓制成透明薄片，再放置于傅里葉變換紅外光譜儀(fourier transform infrared spectrum，FTIR)中進行掃描檢測，掃描波數范圍為4 000～400 cm-1，使用Origin 8.0 軟件進行數據分析。

1.3.4 乙醇體積分數對蕎麥皮粗多糖沉淀量的影響

參考文獻[21]的方法，取離心管標號、稱重并記錄，吸取蕎麥皮提取液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于離心管中，加入無水乙醇定容至8.0 mL，此時乙醇體積分數分別為95%、90%、85%、90%、75%。2～4 ℃條件下過夜，400×g離心10 min，棄上清后放置在天平上稱重，計算差值即為粗多糖沉淀量。

1.3.5 蕎麥皮多糖的顯微鏡觀察及紫外吸收特征峰分析

將蕎麥皮多糖用蒸餾水配成懸濁液(1 mg/mL)，制片，用光學顯微鏡觀察蕎麥皮多糖的形貌特征，以蕎麥淀粉為對照。并用紫外光譜分析多糖溶液在190～400 nm處的特征峰，觀察260、280 nm處是否存在特征吸收峰，以檢測是否含有蛋白質和核酸[22]。

1.3.6 蕎麥皮多糖單糖組成成分分析

參考文獻[23-25]的方法，做部分修改。分別取標準品葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖各1 mg，精密稱量，用蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液。

取單糖標準品200 μL于試管中，加入200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液及200 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，超聲混合后在70 ℃水浴中反應30 min，冷卻后加200 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和反應，再加氯仿萃取3次，合并水層，之后用0.22 μm微孔膜過濾，用HPLC進行分析。

稱取蕎麥皮多糖樣品5 mg于頂空瓶中，加入2 mL 4 mol/L TFA，充氮氣封管，置110 ℃烘箱中烘8 h，多糖經酸水解成單糖。冷卻至室溫，反應混合物經400×g離心10 min后取上清液并用濾紙過濾，用NaOH溶液中和到pH值約7.0。再按上述方法衍生化，讓單糖與PMP試劑反應形成穩定的衍生物，此產物在250 nm處有強烈的紫外吸收，再進行HPLC分析。HPLC測試條件：采用C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；波長250 nm；流動相乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖液。

1.3.7 蕎麥皮多糖的抗氧化特性分析

(1)鐵氰化鉀還原力測定：參考文獻[26-27]的方法，部分修改，取1 mL不同濃度的蕎麥皮多糖溶液于試管中，加入0.2 mol/L pH值6.6磷酸鹽緩沖溶液和質量分數為1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻，在50 ℃條件下水浴20 min，冷卻后加入2.5 mL質量分數為10%三氯乙酸溶液，取混合液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數為0.1%三氯化鐵溶液，混勻，在700 nm波長處測定吸光度。

(2)DPPH自由基清除能力測定：參考文獻[28-29]的方法，稍作改進。稱取3 mg DPPH溶于60 mL無水乙醇中，再取2 mL DPPH溶液于試管中，加入多糖溶液，當DPPH溶液顏色完全褪去時，以此時所加樣品量定義為最大用量，再向前等差遞減4個樣品量。在測試中，當加樣量達到50 μL時，DPPH溶液顏色褪去，向前等差遞減取50、40、30、20 μL四個加樣量。取2 mL DPPH溶液于試管中，加入多糖溶液xμL，再加入(1 000-x)μL蒸餾水至溶液體積為3 mL，避光靜置30 min，在519 nm處測定其吸光度A。用蒸餾水代替樣品，測定其吸光度A0。DPPH自由基清除能力可用公式(2)表示。

(2)

式中：Y，DPPH自由基清除率，%；A0，蒸餾水代替樣品的吸光度；A，樣品的吸光度值。

(3)羥基自由基清除能力測定：參考文獻[30-31]的方法采用水楊酸法。取2 mL多糖溶液于試管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反應30 min后，在波長510 nm處測定吸光度。羥基自由基清除能力用公式(3)表示：

(3)

式中：Y，羥基自由基清除率，%；A，樣品吸光度值；A1，以蒸餾水代替樣品的對照吸光度；A0，以蒸餾水代替樣品和H2O2的吸光度。

1.4 數據處理

2 結果與討論

2.1 溫度對蕎麥皮粗多糖提取率及還原糖含量的影響

采用不同溫度提取蕎麥皮多糖，得到的結果如圖1所示。隨著提取溫度的升高，蕎麥皮粗多糖提取質量百分數顯著升高(P<0.05)。經80 ℃提取的粗多糖質量百分數為5.61%，顯著高于其他各組的提取(P<0.05)，但與90 ℃無顯著性差異(P>0.05)，故選用80 ℃為提取蕎麥皮多糖的最佳溫度。楊淑芳[32]做了蕎麥麩皮粗多糖提取溫度的篩選，也得到了相似的結果。蕎麥皮總糖中還原糖的含量隨著溫度的升高顯著下降(P<0.05)，溫度為50 ℃時還原糖含量最高，這與酶的作用有關，植物中，酶發揮作用的最適溫度一般在40～50℃左右，所以隨著提取溫度的升高酶活性有所降低，還原糖含量也隨之降低。

圖1 溫度對蕎麥皮多糖得率及還原糖含量的影響Fig.1 Effect of temperature on buckwheat husk polysaccharides yield and reducing sugar content

2.2 蕎麥皮多糖的紅外光譜分析結果

不同溫度提取的蕎麥皮粗多糖的傅里葉紅外光譜結果如圖2所示。5組經不同溫度提取的蕎麥皮多糖的紅外圖譜整體趨勢基本相似。

a-e分別為90、80、70、60、50 ℃圖2 不同溫度提取的蕎麥皮多糖的傅里葉紅外光譜圖Fig.2 Original FTIR spectra of buckwheat husk polysaccharides extracted at different temperatures

如圖2所示，在3 359 cm-1左右出現的強吸收峰是O—H伸縮振動，在3 000～2 800 cm-1出現的3組吸收峰是C—H伸縮振動[33]，這都是糖類化合物的特征吸收峰。1 606 cm-1處的強吸收峰是由羰基伸縮振動引起的[34]。1 236、1 396 cm-1出現的吸收峰是C—H變角振動[35]。1 100～1 010 cm-1出現3個吸收峰驗證了此多糖屬于吡喃糖[36]。829、894 cm-1處有弱吸收峰，表明此多糖中既含有α型糖苷鍵，又含有β型糖苷鍵[37]。經不同溫度提取的5組多糖局部峰面積、峰強度有差異但很微小，表明溫度幾乎不會影響蕎麥皮多糖的官能團結構。

2.3 乙醇體積分數對蕎麥皮水提液粗多糖沉淀量的影響

圖3結果表明，隨著乙醇體積分數的升高，多糖沉淀量顯著上升(P<0.05)。這是由于乙醇會破壞多糖的氫鍵，從而導致其在水中的溶解度降低，形成沉淀析出[38]。當乙醇體積分數達到95%時，多糖沉淀量為0.29 g，顯著高于其他各組(P<0.05)。結果表明，在醇沉過程中，乙醇的體積分數越大越有利于多糖的沉淀。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 乙醇體積分數對粗多糖沉淀量的影響Fig.3 Effect of alcohol volume concentration on crude polysaccharide precipitation qualities

2.4 蕎麥皮多糖與蕎麥淀粉形貌特征的比較及紫外光譜分析結果

光學顯微鏡可清晰的觀察到多糖的形貌特征，圖4為放大400倍后觀察到的現象，可見多糖分子是絮狀、鏈狀結構(圖4-A)，淀粉顆粒呈現圓形或橢圓形的環狀結構(圖4-B)，甚至可見臍點，具有常見淀粉的典型特征[39]。通過觀察，多糖的分子結構與淀粉截然不同，且多糖中并未發現類似淀粉結構，結果表明所得的蕎麥皮多糖不含淀粉。

A-蕎麥多糖; B-蕎麥淀粉(放大倍數400×)圖4 蕎麥皮多糖與蕎麥淀粉光學顯微鏡圖Fig.4 Microscopy images of buckwheat husk polysaccharides and starch of buckwheat

蕎麥皮多糖在190～400 nm的紫外掃描結果如圖5所示。由圖可知，多糖在192 nm處出現了強烈的特征吸收峰，且在260 nm和280 nm處未出現吸收峰，結果證明所得多糖中不含蛋白質和核酸。

圖5 蕎麥皮多糖的紫外光譜圖Fig.5 Analyze buckwheat husk polysaccharides on UV spectrum

2.5 蕎麥皮多糖的單糖組成分析結果

經過HPLC分析后，蕎麥皮多糖的單糖組成分析結果如圖6可知，各色譜峰分離度良好，圖中最高峰為溶液中殘留的PMP試劑。蕎麥皮多糖主要由甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其相對質量百分數分別為6.47%、1.18%、9.66%、52.63%、17.26%、12.8%。與顏軍等[40]和趙亮[18]研究的蕎麥粉多糖的單糖組成相比，兩者都含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖，不同的是蕎麥粉多糖還含有鼠李糖，這種差異的產生，可能是因為品種、產地等的不同。上述結果表明蕎麥皮多糖的單糖組成與蕎麥粉多糖存在差異。

峰1-甘露糖;峰2-核糖；峰3-葡萄糖醛酸；峰4-葡萄糖；峰5-半乳糖；峰6-阿拉伯糖圖6 蕎麥皮多糖組成HPLC分析Fig.6 Analyze buckwheat husk polysaccharides compositions on HPLC

2.6 蕎麥皮多糖的抗氧化結果

如圖7-A所示，隨著多糖濃度的升高，其鐵氰化鉀還原能力顯著增強(P<0.05)，鐵氰化鉀還原能力越強，抗氧化效果越好。蕎麥皮多糖對羥基自由基的清除能力隨著其質量濃度的增大呈上升趨勢(圖7-B)。在多糖質量濃度達到0.20 mg/mL時，清除率最高，為10%，但低于VC，一方面可能是由于試驗設定的樣品濃度過低，這有待進一步完善；另一方面，在加熱提取多糖時，高溫使多糖的結構發生改變，進而使其抗氧化效果降低[41]。隨著多糖濃度的增大，其對DPPH自由基的清除能力顯著上升(P<0.05)(圖7-C)。當濃度為27.20 μg/mL時，多糖對DPPH自由基的清除率為68%，顯著大于其他各組濃度(P<0.05)。對照組VC的鐵氰化鉀還原能力和自由基清除能力均大于樣品。以上結果表明，蕎麥皮多糖具有良好的抗氧化效果且具有濃度依賴性，但其抗氧化效果弱于VC。

A-C分別為鐵氰化鉀還原力、羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率圖7 蕎麥皮多糖的抗氧化效果Fig.7 Antioxidant effects of buckwheat husk polysaccharides

蕎麥皮多糖可作為一種天然的抗氧化劑替代合成抗氧化劑，且具有低毒、廉價等優點。但多糖的抗氧化機理較為復雜，主要有2個方面，一是提供電子還原自由基，二是通過調節超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的活性[42]，具體的機制還有待進一步分析。

3 結論

本研究通過水提醇沉法提取蕎麥皮多糖，對其單糖組成和抗氧化特性進行了分析，得到如下結論：蕎麥皮多糖主要由甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，具有良好的抗氧化效果，可作為一種天然抗氧化劑來替代人工合成的抗氧化劑，但其抗氧化效果與多糖結構之間的關系還有待進一步研究。