超高效液相串聯(lián)四級桿-飛行時間質(zhì)譜快速測定食品原料中的氯化血紅素

李偉麗，伍姚，劉玉淑，喻卉，任艷嬌，周文化，吳韜*

1(西華大學 食品與生物工程學院，食品生物技術(shù)重點實驗室，四川 成都，610039)2(中南林業(yè)科技大學 特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410004)

血紅素是由二價鐵離子鑲嵌在原卟啉中而構(gòu)成的鐵卟啉類化合物，可作為血紅蛋白、肌紅蛋白等的輔基成分，主要存在于動物的血液和肌肉中，具有改善貧血、降低肺動脈高壓等作用，在保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應用[1-3]。氯化血紅素(又名血晶素、氯化高鐵血紅素)是一種由4個吡咯環(huán)組成的，含有共軛結(jié)構(gòu)的生物鐵化合物[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，氯化血紅素是一種吸收效果好、無毒副作用的缺鐵性貧血的食品原料及色素添加劑，也可作為過氧化物模擬酶、生物態(tài)鐵劑等，具有廣闊的應用前景[6-9]。

氯化血紅素的檢測方法已有較多報道，包括紫外分光光度法[10]、高效液相色譜法[11]和流動注射化學發(fā)光法[12]等。其中，紫外分光光度法、高效液相色譜法是在特定波長下利用氯化血紅素紫外吸收能力進行的定量分析，如果樣品中存在不易分離的雜質(zhì)干擾，可能會影響測定結(jié)果的準確性。流動注射化學發(fā)光法靈敏度不高，分析時間較長，無法適用于食品中更精確、更微量的分析。超高效液相串聯(lián)四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS)同時具有高效的色譜分離和m/z高分辨率的優(yōu)點，可以同時對食品等復雜體系中的目標成分進行快速地定性、定量分析[13-17]。目前尚未見到利用UHPLC-QTOF-MS測定氯化血紅素的含量研究。本文擬研究建立UHPLC-QTOF-MS方法進行氯化血紅素的定性定量分析，根據(jù)氯化血紅素的精確分子量和二級碎片離子進行準確定量，排除了其他雜質(zhì)的干擾，能夠為氯化血紅素的測定提供有效理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司；X500飛行時間質(zhì)譜，上海愛博才思分析儀器有限公司；BT-25S分析天平，成都世紀方舟科技有限公司；SB-5200DTN超聲清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

NaOH(分析純)、氯化血紅素標品，上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；氯化血紅素保健品樣品(編號為1、2、3、4號)，四川某制藥有限公司；甲醇(色譜純)，Sigma公司，實驗用水均是超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件

色譜柱：采用C18柱(1.8 μm粒徑，2.0 mm i.d×75 mm)；流動相：A相，純甲醇溶液；B相，0.02%甲酸-水溶液(體積分數(shù))；流速：0.25 mL/min；進樣量：2 μL，色譜柱溫度：40℃；采用梯度洗脫，流速保持不變，初始B相為80%，0～2 min，B相60%；2～4 min，B相50%；4～6 min，A相100%，保持2 min；8～9 min，B相80%，保持1 min。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：ESI離子源；掃描方式：MRM正離子模式。質(zhì)譜分析條件：氣簾氣(CUR)35psi，離子化壓力(IS)5500 V，溫度(TEM)300℃，噴霧氣(GS1)45 psi，輔助加熱氣(GS2)55 psi，去簇電壓(DP)80 V，碰撞能量(CE)15 V，掃描范圍m/z100～1 000。

1.2.3 前處理方法

氯化血紅素標準品準備：稱取0.1 mg氯化血紅素標品溶解于1.0 mL 0.10 mol/L NaOH溶液，將標品原液貯存于-18 ℃?zhèn)溆谩Ｓ眉状紝似吩悍謩e稀釋成質(zhì)量濃度2.5、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L。

食品原料樣品準備：分別稱取50.0 mg樣品溶解在1.0 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，超聲提取15 min后，過0.22 μm有機濾膜，吸取濾液1.0 mL，用甲醇稀釋100倍。將稀釋液貯存于-18 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 方法驗證

通過測量加標回收率、基質(zhì)效應、檢出限(limit of detection, LOD)[18]、定量限(limit of quantity, LOQ)、日內(nèi)精密度來驗證方法的可靠性。本實驗選擇具有較高氯化血紅素含量的3號樣品進行方法驗證。采用標準添加法測定氯化血紅素LOD和LOQ，以定量離子信噪比(S/N)3倍所對應目標物的濃度作為LOD，S/N的10倍作為LOQ。通過分析25、50和100 mg/mL 3種加標濃度來確定加標回收率，樣品與加標量的體積比為1∶1，并用公式(1)計算加標回收率[19]。

(1)

式中：Csm是加標測量值;Cm是樣品的測量值;Cs是加標前標準品的濃度。

通過用樣品溶液溶解并稀釋標品來制備基質(zhì)效應的標準曲線，校準曲線2.50～100.00 mg/L。基質(zhì)效應通過公式(2)計算[20-22]。

(2)

式中：a是基質(zhì)校準曲線的斜率;b是溶劑校準曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化血紅素標準品的定性研究

從氯化血紅素標準品溶液的一級質(zhì)譜圖看出(圖1-A)，一級質(zhì)譜的最強離子峰為m/z616，沒有發(fā)現(xiàn)分子離子峰m/z651。其可能原因在于氯化血紅素中氯原子的共價鍵能力較弱，容易在ESI離子化過程中失去，因此選定m/z616 進行二級碎裂。如圖1-B所示，二級離子碎片主要為557.160 2和498.148 1。氯化血紅素分子離子的斷裂特點為母環(huán)不發(fā)生碎裂，只在側(cè)基CH2CH2COOH發(fā)生中性丟失反應。當血紅素分子離子丟失1個CH2COOH時，得到m/z557的碎片離子，而丟失2個CH2COOH時則得到m/z498的碎片離子。為了降低氯化血紅素鐵的檢出限，選擇信號最強的離子對(616.173 2→557.160 2)，采用多反應監(jiān)測模式(MRM)作對氯化血紅素進行定量分析。氯化血紅素標準品在MRM掃描模式下的色譜圖見圖1-C，經(jīng)過色譜優(yōu)化以后，在6.5 min左右實現(xiàn)分離且峰型良好。

圖1 氯化血紅素標準品氯化血紅素標品一級質(zhì)譜圖(A)，氯化血紅素標品二級質(zhì)譜圖(B)，氯化血紅素標品色譜圖(C)Fig.1 Figures of hemin standard mass spectrum of hemin standard(A), MS/MS spectrum of hemin standard(B),chromat-ogram of hemin standard(C)

2.2 血紅素保健品中氯化血紅素定性定量分析

圖2-A是1號保健品的一級質(zhì)譜圖，其最強峰為m/z616。對m/z616進行二級碎裂，其二級質(zhì)譜圖(圖2-B)和氯化血紅素標準品二級質(zhì)譜完全一致，因此確定血紅素保健品含有氯化血紅素。在MRM掃描模式下的提取的色譜圖如圖2-C所示，該樣品峰型較好。其可能原因是采用MRM檢測模式，排除了雜質(zhì)干擾。

圖2 氯化血紅素樣品圖(1號樣品)氯化血紅素樣品一級質(zhì)譜圖(A)，氯化血紅素樣品二級質(zhì)譜圖(B)，氯化血紅素樣品色譜圖(C)Fig.2 Hemin sample (sample No. 1) mass spectrum of hemin sample(A), MS/MS spectrum of hemin sample(B),chroma-togram of hemin sample(C)

按照本實驗所建立的方法，對4份樣品中的氯化血紅素進行定性定量分析，檢測結(jié)果見表1。由表1可知，在4種樣品中均檢測出氯化血紅素，其中4號樣品的氯化血紅素含量最高為7.40%，2號樣品的含量最低為1.16%，1、3號樣品的含量分別為1.40%、7.32%。

表1 樣品中氯化血紅素的含量分析(n=3)Table 1 Analysis of the content of hemin in the sample

2.3 方法的線性范圍，檢出限、定量限和精密度

在設定的UHPLC-QTOF-MS條件下，將氯化血紅素的質(zhì)量濃度(mg/L)作為橫坐標x，氯化血紅素的峰面積作為縱坐標y進行線性回歸，確定回歸方程為y=130 110.294 2x+1 402 020，其相關(guān)系數(shù)(R2)為0.957，線性2.50～100.0 mg/L。由表2可知，氯化血紅素的檢出限和定量限分別為1.25 μg/L和4.00 μg/L，與高效液相色譜法測得檢出限和定量限分別為0.11 mg/L和0.37 mg/L相比[23]，UHPLC-QTOF-MS方法的檢出限和定量限分別降低了88倍和92倍。這表明UHPLC-QTOF-MS方法對于測定氯化血紅素具有更高的靈敏度。根據(jù)SANTE/ 11945/2015歐盟指南[24]，≤20%表明取得較好的精密度。實驗測得RSD為3.84%，表明該方法具有較好的精密度，能夠準確可靠的對氯化血紅素進行定量分析。

2.4 樣品加標回收試驗

為了驗證方法的準確性，本研究選取3號樣品進行加標回收試驗。分別向3號樣品中分別加入25、50、100 mg/L不同質(zhì)量濃度的氯化血紅素標準品，混勻，測定其回收率。每個加標樣品重復測定6次，其結(jié)果見表3。

表2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回歸方程、檢出限、定量限和精密度Table 2 Linear regression equations, correlation coefficient, LOD, LOQ and precision

表3 加標回收率(n=6)Table 3 Spiked recoveries rate(n=6)

由表3可知，3號樣品分別添加3個不同濃度標準品測得的回收率分別為80.65%、91.06%、102.99%，這表明該實驗方法具有較高的回收率。

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應通常表明樣品其他成分對被測組分的影響。基質(zhì)在電離過程中會對目標物的電離產(chǎn)生增強或者抑制作用，這可能會對復雜樣品的定量分析產(chǎn)生不利影響。根據(jù)研究表明[25]，|基質(zhì)效應|≥50%被認為具有強的基質(zhì)效應。由表4可知，氯化血紅素的基質(zhì)效應<50%，表明基質(zhì)對氯化血紅素的定量分析影響相對較弱。

表4 基質(zhì)效應與校準曲線Table 4 Matrix effect and calibration curve

3 結(jié)論

本文首次建立了UHPLC-QTOF-MS快速測定氯化血紅素的分析方法，該方法通過目標物分子量和二級碎片離子進行定量分析。在ESI+電離模式的條件下，氯化血紅素在6.5 min左右達到最佳分離效果，檢測限和定量限分別為1.25 μg/L和4.00 μg/L，回收率范圍為80.65%～102.99%，精密度為3.84%。此方法的優(yōu)勢在于樣品前處理簡單，能夠有效為保健品中氯化血紅素的定性定量測定提供理論依據(jù)。