響應面法優化纖維素酶輔助提取山竹果皮中原花青素的研究

龔玉石，侯方麗，郭 娟，黎英權

（廣東藥科大學食品科學學院，廣東廣州 510006）

山竹（Garcinia mangostana L.），別名鳳果、倒捻子，這種水果原產于馬來群島。其果肉中含有人體所需的多種營養，果皮占單果鮮質量的52%～68%，總體呈紫褐色[1]，其在化工、醫藥、食品等許多領域得到了運用，主要由于山竹含有原花青素、花色苷和氧雜蒽酮等多種活性成分，具有抗癌、抗氧化、鎮痛消炎等多種功效[2-3]。

原花青素，廣泛存在于植物界，是一大類多酚類化合物的總稱，能夠很好地幫助人體清除自由基，對高血壓、腫瘤、衰老、炎癥等起到抵抗作用，能夠保護心血管甚至具有美容功效[4-5]，已被普遍應用于醫藥等多個領域。

很少有人研究山竹精加工工藝，人們通常直接食用山竹的果肉，而山竹果皮在整個果實中約占55%，通常將其視為精加工后的工業廢料或者食用垃圾直接舍棄，這不僅對果皮中所含有的大量活性成分造成浪費，又引起了環境污染問題。國內外現階段對原花青素的提取原料的研究大多為葡萄籽[6-7]、松樹皮[8]、藍莓[9]、蘋果[10]、蓮科植物[11-12]等。人們日益重視對山竹果皮的生物活性組成成分的研究。原花青素在山竹果皮中的含量很高[13]，因此在試驗中選取山竹果皮作為提取材料，從而能對于其提取原花青素的工藝展開研究，對山竹果皮資源的開發具有一定意義，不但有利于開發富含原花青素新的材料，也可以變廢為寶創造山竹果皮更高的經濟效益，拓寬其應用領域。

目前，對山竹活性物質的純化與分離還處于初級階段，以山竹果皮為原料進行原花青素的提取工藝研究較少[14-17]，纖維素酶輔助對山竹果皮原花青素的提取相關工藝未見報道。在細胞壁的組成成分中，纖維素占有重要地位，葡萄糖與纖維二糖是其被纖維素酶分解之后的2個產物，試驗為了提高其提取效率，借助纖維素酶來破壞、降解山竹果皮的細胞壁，從而溶出更多的細胞內容物。而針對響應面法優化纖維素酶輔助提取山竹果皮中原花青素進行研究，以期對相關研究起到一定的借鑒意義，從而有利于今后開展相關的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料：新鮮山竹。

試劑：兒茶素標準品，中國藥品生物制品檢定所提供；C2H5OH，CH3OH，H2SO4，香草醛等，均為分析純。

儀器：電熱恒溫鼓風干燥箱，上海中賢恒溫設備廠產品；SL-1000型移液槍，德國Eppendorfer公司產品；HH-8型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；電子天平，北京聯合科力科技有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制

配制3%香草醛甲醇溶液：在100 mL的CH3OH中溶解已稱量好的香草醛3.0 g。

配制30%硫酸甲醇溶液：在通風廚中，用量筒量取70 mL的CH3OH于燒杯中，然后在攪拌條件下，將30 mL 98%硫酸緩慢加入其中。

1.2.2 標準曲線的繪制

配制母液：精確稱量20 mg的兒茶素對照品，用H2O溶解后移至20 mL的容量瓶中，搖勻備用。分別吸取母液 0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL于10 mL容量瓶中，各自加H2O至刻度后搖勻。然后從這些樣品中分別取0.5 mL移至10 mL比色管中，向其中加入2.5 mL的3%香草醛甲醇與30%硫酸甲醇溶液，于30℃下，避光反應15 min后，以去離子水作為空白，于波長500 nm處測定吸光度（Abs），然后作圖，以質量濃度（mg/mL） 為橫坐標、吸光度為縱坐標，得到Y=0.760 3X+0.002 8，相關系數R2=0.997 7的回歸方程（X表示兒茶素質量濃度，Y表示吸光度）。

1.2.3 山竹果皮中原花青素提取率的計算

式中：C——根據標準曲線得出的原花青素的質量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

W——樣品質量，mg。

1.2.4 山竹果皮原花青素提取的試驗設計

（1）提取。樣品制備：取0.2 g山竹果皮樣品，搗碎后加入50 mL比色管中，加入適量纖維素酶與10 mL的H2O，保持反應溫度不變，進行一段時間的水浴酶解后，將適量的C2H5OH加入其中，在一定的溫度下進行一段時間的水浴提取，過濾后在50 mL容量瓶中用提取溶劑定容，備用。

采用硫酸-香草醛法[18-19]測定原花青素在樣品中的含量：進行空白調零，即將0.5 mL樣品用等量水替代，然后逐步加入2.5 mL香草醛甲醇與2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光處理，于30℃下進行15 min的反應。吸取0.5 mL樣品至比色管，加入2.5 mL香草醛甲醇與2.5 mL硫酸甲醇溶液，避光處理，于30℃下進行15 min的反應，于波長500 nm處測定吸光度A1。對于波長500 nm處的光提取液中的色素也可以吸收，所以將2.5 mL的香草醛甲醇與等量的甲醇溶液加入到0.5 mL的樣液中，進行相同反應步驟測定吸光度A0，則原花青素的吸光度為A=A1-A0[13]，由此能夠對樣品顏色、本底造成的誤差進行消除。然后以原花青素標準曲線為依據對提取率進行計算。

（2）單因素試驗。在保證其他條件相同的情況下改變其中的一個條件，分別考查纖維素酶添加量1%，2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%；乙醇體積分數50%，60%，70%，80%，90%；酶解溫度35，40，45，50，55，60，65，70℃；酶解時間 10，20，40，60，80，100，120 min；提取時間 10，20，30，40，50，60，70 min；提取溫度40，50，60，70，80，90，100℃對山竹果皮中原花青素提取率的影響。

（3） 響應面優化試驗。以Box-Behnken中心組合試驗設計原理為依據，基于單因素試驗，選取對山竹果皮原花青素的提取率影響最大的4個因素進行確定，然后借助響應面法來優化實際的提取條件。在試驗過程中采用Design Expert V8.0.6軟件完成回歸分析。試驗分別選取了纖維素酶添加量、酶解溫度、提取時間和酶解溫度這4個單因素作為優化對象。

Box-Behnken設計因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

表1 Box-Behnken設計因素與水平

2.1.1 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

由圖1可知，原花青素的提取率先隨著纖維素酶添加量的增加而隨之上升，在14%左右獲得最大提取率，之后原花青素的提取率反而隨著纖維素酶添加量增多而減小，這可能是因為隨著纖維素酶添加量的提升，纖維素酶的添加量處于過飽和狀態，使得原花青素的提取率降低。

2.1.2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對原花青素提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

由圖2可知，原花青素的提取率先隨著乙醇體積分數的增大而增大，在80%左右達到提取率最大值，之后原花青素的提取率反而隨著乙醇體積分數的增大而減小。分析原因，可能由于過高體積分數的乙醇對纖維素酶的活性造成了抑制，不利于原花青素的浸出。

2.1.3 酶解溫度對原花青素提取率的影響

酶解溫度對原花青素提取率的影響見圖3。

由圖3可知，在酶解溫度35～60℃時，原花青素的提取率隨著酶解溫度升高而增大，最大值在60℃處獲得，之后呈下降趨勢，這可能是因為酶解溫度升高使得纖維素酶部分或全部變性，酶促反應受到抑制，不利于原花青素的浸出與提取。

2.1.4 酶解時間對原花青素提取率的影響

圖3 酶解溫度對原花青素提取率的影響

酶解時間對原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對原花青素提取率的影響

由圖4可知，原花青素的提取率在10～40 min內隨著酶解時間延長而提高，主要由于延長酶解時間能夠充分利用酶的活性，使得酶解反應較完全，山竹果皮的細胞壁在這個過程中得到的破壞不斷加大，使其中原花青素成分不斷溶出，從而更好地提高提取率。酶解一定時間后，已經幾乎全部溶出了原花青素成分，提取率隨著酶解時間延長而降低，所以最佳酶解時間為40 min。

2.1.5 提取時間對原花青素提取率的影響

提取時間對原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 提取時間對原花青素提取率的影響

由圖5可知，原花青素的提取率會隨著提取時間延長而提高，最大值在30 min處獲得，之后呈下降趨勢。主要原因是由于提取時間不足時，沒有溶出原花青素，但提取時間過長時原花青素的結構可能受到破壞，會溶出部分雜質成分。因此，最佳提取時間選為30 min。

2.1.6 提取溫度對原花青素提取率的影響

提取溫度對原花青素提取率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對原花青素提取率的影響

由圖6可知，原花青素的提取率在一定溫度區間內與提取溫度成正比，最大提取率在70℃獲得。提取溫度升高，提取率卻隨之減小，主要由于過高的溫度會使得其化學結構遭到一定的破壞。所以，最佳提取溫度為70℃。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析方案及結果

通過單因素結果分析可知，纖維素酶添加量、酶解溫度、提取時間和酶解時間這4個因素對山竹果皮原花青素提取率的影響最大。所以，借助Design Expert V8.0.6軟件對這4個因素進行四因素三水平試驗。

響應面分析試驗設計及結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果

將表2中的數據進行回歸分析，最終可得到如下多元二次線性回歸方程式，其反映了各因素在回歸擬合后對于山竹果皮中原花青素提取率Y的影響：

式中：首先要對其中的纖維素酶添加量X1、酶解溫度X2、提取時間X3和酶解時間X4等4個變量進行量綱一線性編碼處理，使得其絕對值大小與影響程度間存在直接聯系，而正負則代表影響的方向性[13]。由于式中各二次項系數均為負值，因此方程一定有極大值點，故而對方程進行優化分析。得出結論為酶解溫度、酶解時間、纖維素酶添加量與提取時間等4個變量對山竹果皮中原花青素影響率的影響程度依次遞減。同時觀察各項系數的絕對值可知，其中的酶解溫度線性項、纖維素酶用量和酶解溫度的交互項，以及各因素的二次項對原花青素得率影響最大。為檢驗方程的有效性，對該模型進行方差分析和顯著性檢驗。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

表3中對該模型進行了方差分析顯著性檢驗，p值小于0.000 1，該模型達到極顯著；失擬檢驗中的p值大于0.05，為不顯著。模型總決定系數R2=0.964 4，即該模型能夠對96%的試驗數據變異現象進行解釋，也即該模型對新數據的預測性極佳。

回歸模型系數顯著性檢驗見表4。

根據表4可知，試驗因素與Y值間不止存在簡單的線性關系，不同變量間的交互作用和二次項也對Y值存在較大影響。其具體表現為：所有二次項影響表現均為極顯著，X2和X1X2影響表現為顯著。

2.2.2 單因素交互作用及分析

對于因變量受到自變量的影響，能夠從自變量和響應值繪制的三維圖中觀察到，其中兩因素交互作用的顯著程度隨著等高線圖越圓而越低。

纖維素酶添加量和酶解溫度對提取率的交互影響見圖7，纖維素酶添加量和提取時間對提取率的交互影響見圖8，纖維素酶添加量和酶解時間對提取率的交互影響見圖9，酶解溫度和提取時間對提取率的交互影響見圖10，酶解溫度和酶解時間對提取率的交互影響見圖11，酶解時間和提取時間對提取率的交互影響見圖12。

圖7顯示了在提取溫度（C） 與酶解時間（D）不變時，原花青素提取率受到纖維素酶添加量（A）與酶解溫度（B） 的交互作用的影響。保持B不變，提取率隨著纖維素酶添加量的增加呈現先大后小的趨勢；保持A不變，提取率的變化趨勢亦是如此。兩者存在明顯的交互作用，且在纖維素酶添加量為13%～15%時原花青素提取率最大。

表4 回歸模型系數顯著性檢驗

圖7 纖維素酶添加量和酶解溫度對提取率的交互影響

圖8顯示，纖維素酶添加量和提取時間對原花青素提取率的影響，可以看到在控制酶解溫度和酶解時間2個變量不變時，可以完全不考慮提取時間這一影響因素。這與顯著性分析的結果一致。

圖9顯示，不變的兩因素為酶解溫度和提取時間，主要研究原花青素提取率受纖維素酶添加量與酶解時間交互作用的影響。

圖8 纖維素酶添加量和提取時間對提取率的交互影響

圖9 （a） 顯示，纖維素酶添加量不變時，隨著酶解時間的增加，提取率反而表現出來降低的現象，也就是說，就原花青素提取率而言，A和D間的相互作用對其影響較小。

圖10顯示，不變的兩因素為纖維素酶添加量與酶解時間，取變量酶解溫度和提取時間進行研究，當酶解溫度一定時，原花青素提取率隨著提取時間延長的變化趨勢為先增后減，而當提取時間不變時，提取率的變化趨勢亦是如此。這就充分表明了這二者并不存在明顯的交互作用。

圖11顯示，纖維素酶添加量與提取時間保持不變，對酶解時間和酶解溫度進行調整，研究二者的交互作用是如何影響提取率的。酶解時間和酶解溫度分別不變時，隨著自變量增大，提取率表現出先增加后減小的現象。而二者之間的交互作用并沒有明顯的反映。

圖9 纖維素酶添加量和酶解時間對提取率的交互影響

圖10 酶解溫度和提取時間對提取率的交互影響

圖11 酶解溫度和酶解時間對提取率的交互影響

圖12 酶解時間和提取時間對提取率的交互影響

圖12 顯示，不變量為纖維素酶添加量與酶解溫度，提取時間和酶解時間改變。在圖12（a）中，提取時間不變，提取率隨酶解時間的增加先升高后降低；反之，當酶解時間不變時，提取率隨提取時間的增加呈相同變化趨勢。總體上這2種因素交互作用影響不大。

2.2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

對于提取山竹果皮原花青素的工藝，其最適合的提取條件為纖維素酶添加量13.99%，提取時間30.14 min，提取溫度70℃，酶解時間39.06 min，酶解溫度59.57℃，乙醇體積分數80%，在這樣的條件下，理論上提取率為25.52%，實際提取率為25.43%，二者相較，僅存在0.35%的誤差。由此認為此模型能夠適用于試驗，確立的最佳條件具有較高的可靠性。

3 結論

首先選取了6種單因素進行試驗，在選取的過程中主要根據其可能對山竹果皮中原花青素的提取率產生影響的單因素，并分別探索其中的影響程度。結果表明，在纖維素酶添加量14%，提取時間30 min，提取溫度70℃，酶解時間39 min，酶解溫度59.5℃，乙醇體積分數80%條件下，獲得最大提取率，但是最佳提取條件并非簡單的各因素最佳值的結合。鑒于試驗的可行性，從中選取了纖維素酶添加量、酶解時間、酶解溫度、提取時間這4項對提取率影響最大的單因素進行響應面優化分析。

制定四因素三水平的方案，然后經過相應的回歸擬合處理，得到響應值為Y的回歸方程。由方程一次項系數知道，酶解溫度、酶解時間、纖維素酶添加量、提取時間對提取率的影響逐漸減小。再觀察其他項可知，酶解溫度、酶解時間、纖維素酶用量、提取時間這4個因素的二次項對提取率的影響均表現為非常顯著；而在較大程度上影響提取率的因素為酶解溫度、纖維素酶添加量和酶解溫度的交互作用。

最后，利用Box-Behnken中心組合試驗設計，對于山竹果皮提取原花青素的工藝，其最佳的提取條件為纖維素酶添加量13.99%，提取時間30.14 min，提取溫度70℃，酶解時間39.06 min，酶解溫度59.57℃，乙醇體積分數80%，在這樣的條件下，理論上提取率為25.52%，實際提取率為25.43%，二者相較，僅存在0.35%的誤差。由此認為此模型能夠適用于試驗。另外，與沒有添加纖維素酶的實際提取率17.38%[13]相比，山竹果皮中原花青素的提取率提高了約8%。

原花青素在山竹果皮中的含量豐富，將提取材料選為果皮不僅充分利用其經濟價值，也增添了新的材料來提取原花青素。在傳統提取工藝中添加纖維素酶，能夠在很大程度上提高原花青素提取率，也為今后的相關工藝起到一定的借鑒意義。