產乳酸芽孢桿菌制備高黃酮含量的砂仁發酵飲料

劉玉冰，梁鉆好，黎 攀，夏 雨，吳俏槿，杜 冰

（1.廣州丹吉兒生物科技有限公司，廣東廣州 510642；2.陽江職業技術學院，廣東陽江 529566；3.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；4.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山 528437）

砂仁，姜科，豆蔻屬多年生草本植物，與檳榔、益智仁、巴戟天并稱“四大南藥”。砂仁集中分布于我國福建、廣東、廣西和云南等地。中醫和臨床驗證認為砂仁具有暖脾止瀉、化濕開胃、鎮痛、行氣安胎、解酒醒神等功效[1-2]，其中主要的藥理活性成分以揮發性油和黃酮類物質為主。砂仁富含黃酮類物質（不同產地的平均含量為0.25～0.90 mg/g）[3-4]，目前已從砂仁的水溶性成分中分離鑒定出槲皮苷、異槲皮苷和槲皮素[4-5]3種黃酮類物質。黃酮類物質具有很強的抗氧化和清除自由基的能力，不僅可以賦予飲料保健功效，還令飲料口感圓潤。

植物次生代謝產物的微生物轉化是近年來的研究熱點[6]，而且有研究表明，微生物發酵可提高中草藥的黃酮含量。如酵母菌[7]和黑曲霉[8]發酵黃芪可分別提高黃酮含量18%和129%；米曲霉和米根霉發酵紫米也可大幅提高（190.1%和122.5%） 總黃酮含量[9]；釀酒酵母發酵風柜斗草所獲得的發酵液中總黃酮含量是水提液的2.6倍，其DPPH自由基和羥自由基清除能力均優于水提液的[10]。黃酮類物質轉化的常規菌種為大腸桿菌[11-12]和釀酒酵母[13-14]，還可以考慮絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌等其他微生物[15]。微生物的轉化作用是復雜的，菌種、營養環境、原料特征等都會影響具有生物活性的次生代謝物的轉化。如李寧等人[16]篩選的6株菌株中，只有1株具有高效轉化藜蒿水提液總黃酮含量的能力，其他5株都會降低或不改變藜蒿水提液的黃酮含量。產乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillus sp.DU-106） 是經華南農業大學鑒定的一株新的芽孢桿菌屬[17]，已應用于多種中草藥[18-20]、谷物[21]、果蔬[22]的發酵中，其發酵飲料口感和風味均較佳。試驗采用產乳酸芽孢桿菌DU-106發酵砂仁，探究發酵工藝對砂仁發酵飲料中總黃酮含量的影響，為砂仁黃酮的微生物轉化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南砂仁，購于當地藥店；產乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillus sp.DU-106），篩選自傳統發酵奶酪，由華南農業大學新資源食品與功能性原料評價及研究中心鑒定和保藏；橙皮苷標準品，HPLC＞98%；氯化鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、二甘醇，均為分析純。

FA2004A型分析天平，上海精天電子儀器廠產品；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州市華普達數學儀器有限公司產品；DHP-600型電熱恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器廠產品；752-N型紫外分光光度計、PHs-3C型精密pH計，上海精密科學儀器有限公司產品；WYT型手持糖量計，泉州中友光學儀器有限公司產品；VD-650型桌上式潔凈式工作臺、DF-101S型高壓滅菌鍋，蘇州凈化設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌種活化

0.1 g產乳酸芽孢桿菌DU-106菌粉溶于100 mL已滅菌并冷卻至室溫的生理鹽水中，于30℃下活化30 min，得到菌種活化液。

1.2.3 單因素試驗

稱取去殼砂仁50 g，洗凈后用100℃水熱燙1～3 min，瀝干水分，用紗布包好后加入300 mL煮沸放涼的水（內含30 g溶化的白砂糖），接種發酵（發酵期間用已消毒的小石頭把砂仁壓下去，確保砂仁不上浮在液面）。固定發酵溫度26℃，發酵時間4 d，分別接種0.6%，1.8%，3.0%，4.2%，5.4%菌種活化液（以去殼砂仁的量計算），考查接種量對發酵飲料總黃酮含量的影響；固定接種量為3.0%，發酵溫度26℃，分別發酵2，3，4，5，6 d，考查發酵時間對發酵飲料總黃酮含量的影響；固定接種量為3.0%，發酵時間4 d，分別在20，23，26，29，32℃下發酵，考查發酵溫度對發酵飲料總黃酮含量的影響。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上進行L9（34）正交試驗，以接種量、發酵溫度和發酵時間為因素，每個因素各取3個水平。以總黃酮含量為指標，得出砂仁飲料發酵的最佳條件。

1.2.5 指標測定

總黃酮含量：參照NY/T 2010—2011柑橘類水果及制品中總黃酮含量的測定的方法測定發酵液中總黃酮含量；可溶性固形物含量采用手持糖量計測定；pH值采用pH計測定。

黃酮標準曲線見圖1。

圖1 黃酮標準曲線

1.2.6 感官評價

參照NY 82.2—1988果汁測定方法感官檢驗對砂仁發酵飲料進行感官評分。選取12名有經驗的發酵飲料人員進行感官評價，得到的結果去掉最高值和最低值后取平均值。

砂仁發酵飲料評分細則見表1。

2 結果與分析

2.1 接種量對總黃酮含量的影響

表1 砂仁發酵飲料評分細則

接種量對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖2。

圖2 接種量對砂仁飲料總黃酮含量的影響

由圖2可知，隨著接種量的增加，發酵飲料中總黃酮含量不斷增加，當接種量增加到4.2%時，飲料中總黃酮含量達到最高值，比0.6%的接種量高出34.4%。隨后接種量繼續增加，總黃酮含量略有下降。因此，以4.2%的接種量為宜。

研究表明，部分芽孢桿菌菌株可高效轉化黃酮類物質[15-16]。產乳酸芽孢桿菌DU-106為芽孢桿菌屬，兼性厭氧，一定的接種量可以加快消耗原料中的少量氧氣[19]，促進繁殖和發酵的同時避免所轉化的黃酮被氧化，確保黃酮保留高抗氧化活性。但是當接種量過大時，微生物繁殖過量，營養受限，發酵作用會受到抑制[19]，阻礙轉化。

2.2 發酵時間對總黃酮含量的影響

發酵時間對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 發酵時間對砂仁飲料總黃酮含量的影響

由圖3可知，發酵時間較短時，飲料中總黃酮含量緩慢增加，發酵時間延長（3～4 d），總黃酮含量急劇增加，并在5 d達到最高值0.632 mg/g，隨后發酵時間繼續延長，總黃酮含量略有下降。

由于微生物菌株差異較大，其對黃酮的轉化速率也存在較大的差異，高效轉化時間從幾小時到幾天不等[16，23]。趙丹等人[9]采用米根霉發酵紫米，于27℃下發酵2.5 d獲得最高黃酮含量（0.222 mg/g），郝紅梅等人[7]采用酵母發酵黃芪，于28℃下發酵7 d獲得最高黃酮含量（2.212 mg/g）。從總黃酮含量-發酵時間的變化曲線來看，試驗采用的產乳酸芽孢桿菌DU-106在26℃下發酵砂仁，最適發酵時間為4～6 d。

2.3 發酵溫度對總黃酮含量的影響

發酵溫度對砂仁飲料總黃酮含量的影響見圖4。

圖4 發酵溫度對砂仁飲料總黃酮含量的影響

發酵溫度對飲料中總黃酮含量有顯著影響。20～29℃時，飲料中總黃酮含量幾乎隨發酵溫度的增加呈直線上升，溫度每上升1℃，總黃酮含量增加0.040 mg/g。發酵溫度為29℃時，總黃酮含量是發酵溫度為20℃時的2倍以上。隨后發酵溫度繼續上升，變化曲線趨于平緩。

產乳酸芽孢桿菌DU-106轉化砂仁總黃酮含量的最佳溫度為29～32℃，與李寧等人[16]篩選芽孢桿菌屬菌株轉化藜蒿水提液總黃酮含量的最佳溫度（30℃）一致。一方面，這與產乳酸芽孢桿菌DU-106最適活化溫度30℃有關，另一方面體現了微生物對植物次生代謝物的轉化通常在溫和條件下進行[6]，相比黃酮的常規高溫熱水（85～100℃） 浸提法或有機溶劑浸提法，微生物轉化法具有反應條件溫和、環境友好化、避免有機溶劑殘留或污染等問題。再者，由于溫和反應，相比常規的熱水浸提法，微生物所轉化的黃酮類物質可能獲得更高的活性[10，23-24]。

2.4 正交優化試驗

因素與水平設計見表2，L9（34）正交試驗設計及結果分析見表3。

表2 因素與水平設計

由表3極差分析得知，采用產乳酸芽孢桿菌DU-106發酵砂仁，影響總黃酮含量的因素順序為C＞A＞B，即發酵溫度＞接種量＞發酵時間。

正交試驗方差分析見表4，砂仁發酵飲料物化指標見表5。

表4方差分析顯示，因素C的影響達到高度顯著水平（p＜0.01），因素A和B的影響未達到顯著水平（p＞0.05），與直觀分析結果一致。

最佳工藝條件為A2B1C2，即接種量4.2%，發酵時間4 d，發酵溫度29℃，在此條件下得到的總黃酮含量為0.725 mg/g。測得該條件下的砂仁發酵飲料的pH值為4.23，可溶性固形物含量為5.74%，感官評分16.9分，總體評價好。

表3 L9（34）正交試驗設計及結果分析

表4 正交試驗方差分析

表5 砂仁發酵飲料物化指標

3 結論

利用產乳酸芽孢桿菌DU-106轉化砂仁總黃酮，在單因素試驗的基礎上進行正交優化試驗，得到最佳工藝條件。影響總黃酮含量的因素順序為發酵溫度＞接種量＞發酵時間，接種量4.2%，發酵時間4 d，發酵溫度29℃，此時砂仁發酵飲料可獲得高達0.725 mg/g的總黃酮，對應的飲料pH值為4.23，可溶性固形物含量為5.74%，感官評分16.9分。微生物轉化反應條件溫和、轉化率高，同時有望獲得高活性的黃酮類物質，賦予中草藥發酵飲料更佳的保健功效。