蒲公英內生真菌分離純化及其形態學鑒定

趙 秋，丁海娥，黨苗苗，陳 思，張道順，從炳超

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

近年來，已經成為生物制藥有效途徑之一的是將生物活性成分從天然產物中提取出來[1-2]。挑選天然藥物最主要的原料一直以植物為主，但用于藥用的植物中活性物質在其組織中含量一般很低，如果為了自身利益，人們一直過度使用野生藥用植物資源，該物種就會瀕危直至滅絕，這樣就會使環境遭到破壞，還會破壞生物多樣性。為了解決環境資源問題，近年來，研究了野生藥用植物的熱點，重點是藥用植物的內生真菌。其內生真菌的研究始于19世紀后期，國內對內生真菌的研究才剛剛開始[3-4]。到20世紀90年代中期，研究內容僅限于對植物中某些內生真菌的研究[5]。利用內生真菌生產藥理成分可以為尋找天然藥物資源和保護植物資源提供新途徑[6-7]。

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand-Mazz），是多年生草本植物。根部呈圓錐形，表面呈棕色，萎縮，葉片邊緣有時呈波浪狀或羽狀，基部逐漸變窄為葉柄，葉柄和主脈通常呈紅紫色，花萼上部為紫紅色，密布在蜘蛛絲上。白色具長柔毛；花頭呈鐘形，瘦果深褐色，長冠毛白色，開花期4月至翌年10月。蒲公英主要含有的化學成分包括黃酮類、三萜類化合物、倍半萜烯內酯類、色素類、揮發油類和植物甾醇類，具有清熱解毒、利尿通淋、消腫散等多種功能[8]。

內生真菌，在學術界沒有一個準確的定義。內生菌的最早概念是指通過區分生活在植物表面的一些附生植物來生活在植物中的微生物。內生真菌是指宿主植物在某一階段或生命的所有階段都不會表現出外部疾病癥狀并生活在健康植物組織或器官中的微生物。研究表明，內生真菌的祖先可能是植物病原體，長期存在于植物組織中，與寄主植物“共同進化”，因此在此過程中，形成的代謝物可能與宿主植物相同或相似。許多物質都有多種活性。內生真菌，從不同植物中分離純化出來，其種類數目不同，少的有幾種到十幾種，多的有幾百種。通過對蒲公英內生真菌的培養、純化和鑒定，為將藥用微生物資源更好地開發奠定堅實基礎。

1 試驗材料

1.1 試驗所用植物的材料來源

蒲公英取自西北民族大學格物1號樓正前方玫瑰園內，由試驗指導教師郭俊珍鑒定。

1.2 儀器

ISO 9001型電子分析天平，北京賽多利斯儀器公司產品；VS-1300-U型超凈工作臺，蘇州止痙凈化設備有限公司產品；SPX-100B-Z型生化恒溫培養箱、MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司產品；FT-101A型電熱鼓風干燥箱，北京科威永興儀器有限公司產品。

1.3 玻璃儀器

量筒、玻璃棒、燒杯、培養皿、錐形瓶等。

1.4 藥品與試劑

75%酒精，山東利爾康消毒科技有限公司提供；升汞0.1%（分析純），北京化工廠提供；葡萄糖（分析純），上海化學試劑廠提供；瓊脂粉，上海山浦化工集團提供；注射用青霉素鈉（80萬U）、注射用硫酸鏈霉素（100萬U），華北制藥集團提供。

1.5 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。

2 試驗方法

2.1 制作培養基

稱取土豆200 g，經清潔、去皮后切成塊，用蒸餾水煮沸，紗布折疊成8層，然后過濾，加入20 g葡萄糖，并加入20 g瓊脂。化妝用1 L量筒至1 000 mL和分配到3個錐形瓶中，然后用高壓蒸汽鍋滅菌。除菌后，將介質的溫度降低至約55℃，并加入青霉素鈉的80×104U和100×104U硫酸鏈霉素去除內生細菌。倒30個平板，放置于超凈臺內，等待接種。

2.2 內生真菌的培養

選擇沒有害蟲和傷口的新鮮蒲公英并用無菌水沖洗。在超潔凈平臺上，采用組織切割法采集植物的莖、葉和根，用手術刀將蒲公英的莖和根切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，0.5 cm×0.5 cm的小塊。將切割的材料置于乙醇中2，4 min，并比較消毒時間。將混合物用蒸餾水洗滌3次，然后將該材料置于浸有汞的溶液中浸泡2 min，用蒸餾水沖洗3次，并置于無菌濾紙上。吸去水后，將其分別置于含有硫酸鏈霉素的培養基上，在各板上放置4片，密封膜，在30℃的培養箱中培養3～7 d。

另在一個平板內倒入無菌水，與上述平板一起放入培養箱中，觀察是否有細菌長出，作為無菌參照。

2.3 分離與純化

菌落出現在切口。根據菌落形態、色差和生長時間，挑取每個菌落的邊緣菌絲并轉移到分離培養基平板進行再培養。培養數天后，觀察并記錄菌落的形態。

在最后一次沖洗后，取少量表面消毒的無菌水，將其涂于含有硫酸鏈霉素（100 U/mL） 和青霉素鈉（80 U/mL）的分離介質上，并在30℃下孵育。觀察是否有任何真菌長出作為無菌處理的參考。

將獲得的菌株反復純化并培養。菌株編號后，將其轉移到PDA傾斜培養基中，置于28℃培養箱中培養5～7 d，并貯存在4℃冰箱中。

3 結果與分析

3.1 蒲公英內生真菌的分離結果

從新鮮蒲公英根部、莖部、葉部分離獲得14株內生真菌，分別編號PY-1～PY-14。

純化菌落PY-1見圖1，純化菌落PY-2見圖2，純化菌落PY-3見圖3，純化菌落PY-4見圖4，純化菌落PY-5見圖5，純化菌落PY-6見圖6，純化菌落PY-7見圖7，純化菌落PY-8見圖8，純化菌落PY-9見圖9，純化菌落PY-10見圖10，純化菌落PY-11見圖11，純化菌落PY-12見圖12，純化菌落PY-13見圖13，純化菌落PY-14見圖14。

3.2 蒲公英內生真菌的形態學觀察及初步鑒定

從蒲公英內分離得到的內生真菌，菌落形式豐富多樣，菌絲形態也不同，有絨、粉、絮狀、顆粒等。每個菌落的顏色和色素沉著也有各自的特點。沒有產生色素的細菌和產生色素的細菌；有常見的菌落顏色，如白色和黑色，以及深綠色、亮黃色、灰綠色、粉紅色等；邊緣整齊和爬壁菌絲，進一步表明內生真菌物種的多樣性。

所分離內生真菌菌株編號及初步形態學觀察見表1。

4 結論

作為微生物資源的植物內生微生物，較普遍地存在于植物中。與通常的微生物相比，植物內生微生物對植物表現出一定的親和力。植物又是內生微生物賴以生存的物質基礎，植物生產極大地關系到社會的繁榮和發展。因此，植物內生微生物研究、資源的積累及其操作技術和利用技術的研究有著重要意義[9]。

圖1 純化菌落PY-1

圖2 純化菌落PY-2

圖3 純化菌落PY-3

圖4 純化菌落PY-4

圖5 純化菌落PY-5

圖6 純化菌落PY-6

圖9 純化菌落PY-9

圖10 純化菌落PY-10

圖11 純化菌落PY-11

圖12 純化菌落PY-12

圖13 純化菌落PY-13

圖14 純化菌落PY-14

表1 所分離內生真菌菌株編號及初步形態學觀察

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）用作試驗的培養基。使用組織切割方法，組織塊消毒時間的平行試驗在試驗期間進行，用酒精消毒的時間為1，2，3，4 min。結果表明，酒精最適消毒時間為2 min，接種消毒1 min組織的培養基上長有雜菌，接種消毒3 min組織的培養基內生真菌基本不生長，接種消毒4 min組織的培養基不生長內生真菌；用于消毒和沖洗材料的無菌水被電鍍和培養；如果板上沒有長細菌，則表面消毒相對徹底；有14株內生真菌從蒲公英中分離純化出來。

據觀察，大多數組織塊在3 d在組織切割切口處生長了菌絲體，并且應該是組織中的主要菌株；有些菌株直到6 d才出現甚至更長時間。這些菌株的生長速度也相對較慢。而且，根據觀察發現不同植物組織中內生真菌的種類不同，生長速度都不盡相同。

此研究與其他類似研究相比，在蒲公英根系和莖內分離出菌種數量較多，形態各異，菌種多樣性和特殊性大于其他類似研究的成果。藥用植物組織中存在著多樣的菌落特征和豐富的色澤，不同植物組織內的真菌的種類和數量不同，藥用植物蒲公英組織的內生真菌也不同。多種次級代謝產物由內生真菌產生，這些次級代謝產物能夠用于很多新藥的研發，對下一步的菌種形態學和生理生化功能鑒定等試驗提供了基礎。