B7-H3對人肝癌細胞生物學特性的影響及臨床意義

梁詩琪， 張香西， 莊小津， 王鈺禾， 鄒秋琴， 張文敏

在我國，肝細胞癌(hepatocellullar carcinoma, HCC)是僅次于胃癌和肺癌的第三大癌癥，預后極差，患者5年生存率僅為10.1%[1]。HCC的生長與轉移是導致腫瘤預后不良的重要因素，因此尋找有效的抑制腫瘤生長轉移的靶標尤為迫切。

近年，共刺激分子B7-H1(PD-L1)分子已應用于多種惡性腫瘤的治療并取得良好的臨床療效[2]，B7-H3作為與B7-H1有20%～27%同源性的B7家族的另一成員逐漸受到重視[3]。B7-H3最初報道于2001年，是T細胞活化時起關鍵作用的協同刺激分子，對免疫強度的維持尤為重要。已有研究表明，B7-H3在正常組織器官中表達極微，卻顯著高表達于多種腫瘤組織或細胞，且表達量與腫瘤的生長及轉移等生物學特征相關[4-5]。腫瘤的生長是與細胞增殖和凋亡直接聯系的，腫瘤發生轉移的必要條件之一是遷移和侵襲。本研究首先從細胞層面進行分析，通過下調B7-H3的表達，觀察HCC細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學特性的改變，接著進一步在組織水平研究B7-H3蛋白的表達與HCC臨床病理特征的關系，進而探尋HCC診斷和治療的有效分子靶點。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 高糖DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；B7-H3 siRNA(上海Genepharma公司)；Lipofectamine?3000和SYBR?Green 實時熒光定量PCR預混液(美國Thermo公司)；逆轉錄試劑盒(瑞士Roche公司)；鼠抗人B7-H3單克隆抗體(ab105922，英國Abcam公司)；Transwell小室(內徑6.5 mm，孔徑8.0 μm，美國Milipore公司)；基質膠及Anexin FITC/PI雙染試劑盒(美國BD公司)；CCK-8(北京全式金生物技術有限公司)；即用型免疫組織化學ElivisionTMplus試劑盒(福州邁新公司)。

1.1.2HCC組織及細胞株 收集2002年11月—2009年2月福建醫科大學附屬孟超肝膽醫院接受肝癌手術治療的HCC患者80例，男性66例，女性14例，年齡中位數50.6歲(29～71歲)。1年內復發46例，1年后復發34例，分別制作兩張組織芯片。人原代HCC細胞株MHCC97L,MHCC97H,Hep3B,HepG2,Huh 7,SK-hep-1及LM3均來自福建醫科大學孟超肝膽醫院肝病研究室。復蘇后用含10% FBS的DMEM培養基培養，待細胞長至瓶底的80%～90%時傳代。

1.2方法

1.2.1B7-H3 siRNA的合成及細胞轉染 從GenBank網站獲取人B7-H3的mRNA序列(NM 001024736)，由上海Genepharma公司根據siRNA的設計原則，合成以下3條siRNA片段：

siRNA-435：5′-GCAGCUGACAGAUACCAAA-3′

siRNA-2068：5′-CAACCUUAGUUCUCUAAGU-3′

siRNA-3237：5′-CUGGUAGAGUGAGACUUCA-3′

將細胞接種于六孔板(3×105個/孔)，待細胞鋪滿60%時進行轉染：將Opti-MEM?(每孔100 μL)與Lipofectamine?3000(每孔4 μL)輕輕混勻并靜置5 min；將Opti-MEM?(每孔100 μL)與B7-H3-siRNA(每孔2.5 μg)輕輕混勻并靜置5 min；兩管輕輕混勻并靜置25 min，均勻滴加至六孔板,培養48 h。經Western-blot和q-PCR后，選擇干擾作用最明顯的一條siRNA進行細胞增殖、凋亡和侵襲遷移實驗。

1.2.2Western-blot 用胰酶將細胞消化離心，BSA法進行蛋白定量，加入上樣緩沖液100 ℃煮10 min，制膠后依次上樣進行蛋白電泳(100 V，60 min)，轉NC膜(100 V，60 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，B7-H3一抗(1∶1 000)及β-actin一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，羊抗鼠二抗(1∶2 000)孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色成像。

1.2.3q-PCR Trizol充分裂解細胞，按照Takara公司的Prime ScriptTMRT試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應，按Takara real-time PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR(20 μL體系)，用目的基因與內參的Ct值計算ΔT和ΔΔT值，2-ΔΔT表示基因相對表達量。引物序列如下，反應條件為：95 ℃ 2 min→95 ℃ 10 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，循環40次；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s。

B7-H3：

F：5′-GCTGTCTGTCTGTCTCATTGC-3′

R：5′-ATTTCTTGTCCATCATCTTCTTTGC-3′

內參基因18 s：

F：5′-AGAAACGGCTACCACATCCA-3′

R：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′

1.2.4細胞劃痕 向劃痕槽加入密度為2×106mL-1的細胞懸液70 μL，12 h后若細胞長滿則撤掉劃痕槽，PBS輕柔洗后加入培養基2 mL，視細胞生長情況于一定時間間隔(MHCC97L細胞株拍照時間為1，24，48，72 h;SK-hep-1細胞株拍照時間為1，6，10 h)通過倒置顯微鏡拍照并記錄劃痕愈合情況。

1.2.5Transwell小室實驗 將Transwell小室的上室均勻鋪上50 μL稀釋的基質膠，放入培養箱約3 h后凝固(無血清DMEM∶基質膠為1∶5；檢測遷移能力無需鋪膠)。上室加細胞密度為1×105mL-1的無血清細胞懸液200 μL，下室加600 μL含20% FBS的DMEM，觀察到下室有貼壁細胞(約24 h)后吸盡上室液體，加4%多聚甲醛500 μL固定30 min，吸去多聚甲醛，加入Gimesa染色液染色60 min，PBS洗3次，用棉簽擦凈基質膠和上室細胞，顯微鏡下拍照。

1.2.6CCK-8增殖實驗 96孔板每孔中加入密度為3×104mL-1的細胞懸液100 μL，分別于8，24，48及72 h配置培養基與CCK-8(9∶1)的混合液100 μL，以換液的形式加入，培養箱中培養1.5 h后，培養基由粉紅色變棕色，用酶標儀測定OD450值。

1.2.7流式細胞術 取密度為1×106mL-1的細胞懸液100 μL接種于24孔板中，加入1 mL培養基培養24 h，轉移每孔上清、PBS清洗液后進行細胞消化，消化液轉移至離心管，300 r/min離心5 min，棄上清。加入1×Annexin V 混合液100 μL，向細胞懸液中加入Annexin V-FITC 結合物或PI染液(均為5 μL)，制備無染、PI單染、FITC單染及雙染4個實驗組，室溫下避光培養15 min，加入300 μL 1×Annexin V 混合液，于1 h內檢測。

1.2.8組織芯片的制作及免疫組織化學染色 觀察HCC標本H-E染色切片，確定芯片取點位置，每個標本同時選取癌及癌旁組織兩點，用空心管(管徑0.1 cm)從選取的蠟塊中穿取組織，并規律排列于穿孔的空白受體蠟塊，將組織陣列塊在52 ℃烤箱中加熱融合，連續做4 μm切片，H-E染色后進行免疫組織化學染色。取出組織芯片，脫蠟、水化后，放入裝有1 mol/L檸檬酸的組織化學盒中，高溫高壓抗原修復3 min，滴加3% H2O2孵育10 min。加鼠抗人B7-H3抗體(1∶1 000)，37 ℃水浴鍋中孵育1 h，采用Elivision兩步法，滴加增強劑、酶標抗鼠聚合物后，DAB顯色5 min，蘇木精復染，1%鹽酸分化，流水沖洗返藍后中性樹膠封片觀察。

1.3統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件分析數據，采用Image J軟件分析圖片，計數資料采用卡方檢驗，兩組間比較采用Stueent’st檢驗，P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western-blot及q-PCR技術檢測不同HCC細胞B7-H3的表達 B7-H3蛋白及mRNA在不同HCC細胞中有不同程度表達，其中SK-hep-1和MHCC97L細胞株表達程度較高，故選取該兩種細胞株完成后續實驗(圖1)。

2.2Western-blot及q-PCR技術檢測B7-H3-siRNA片段抑制情況 采用Western-blot及q-PCR技術，檢測SK-hep-1和MHCC97L細胞株中3條siRNA片段對B7-H3蛋白和mRNA表達的抑制情況，結果顯示，3條siRNA片段均有不同程度抑制，其中siRNA-435在MHCC97L細胞抑制效率達68%，在SK-hep-1細胞抑制效率達90%，選用該條帶完成后續實驗(圖2)。

A,C:Western-blot檢測； B:q-PCR檢測.圖1 Western-blot及q-PCR技術檢測肝癌細胞B7-H3蛋白及mRNA的表達Fig 1 The expression of B7-H3 protein and mRNA in HCC cells was detected by Western-blot and q-PCR respectively

A，C：q-PCR及Western-blot技術檢測MHCC97L細胞株；B，D：q-PCR及Western-blot檢測SK-hep-1細胞株.圖2 不同siRNA片段對SK-hep-1和MHCC97L肝癌細胞株B7-H3的抑制效果Fig 2 Inhibition effect of different siRNA fragments on B7-H3 of two liver cancer cell lines

2.3細胞劃痕檢測細胞平面遷移能力 轉染siRNA-435 48 h后沉默SK-hep-1和MHCC97L的B7-H3表達后，通過細胞劃痕實驗，在一定時間間隔內檢測兩種細胞株的平面遷移能力，結果顯示兩種細胞株的遷移能力均顯著下降(圖3)。

2.4Transwell小室檢測細胞侵襲能力 轉染siRNA-435 48 h后沉默SK-hep-1和MHCC97L的B7-H3表達后，通過Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力，結果顯示兩種細胞株侵襲能力均顯著下降(圖4)。

2.5CCK-8檢測細胞增殖和凋亡情況 轉染siRNA-435 48 h后沉默SK-hep-1和MHCC97L肝癌細胞株B7-H3的表達，通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，結果顯示兩種細胞株的增殖未見明顯改變(圖5)。通過流式細胞技術檢測細胞凋亡情況，結果顯示在SK-hep-1和MHCC97L細胞沉默B7-H3前后細胞凋亡情況比較差別無統計學意義。SK-hep-1細胞中siRNA-435組的總凋亡為(24.81±2.70)，與未轉染組(19.74±2.67)和NC組(19.37±0.69)比較差別也不具有統計學意義。

A，C：MHCC97L細胞株；B，D：SK-hep-1細胞株. 與NC組比較，☆:P<0.05, ☆☆:P<0.01.圖3 細胞劃痕實驗檢測SK-hep-1和MHCC97L的平面遷移能力Fig 3 The migration ability of two cell lines was detected by cell scratch test

A，C：MHCC97L細胞株(×100)；B，D：SK-hep-1細胞株(×100). 與NC組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖4 Transwell小室檢測SK-hep-1和MHCC97L細胞的遷移及侵襲能力Fig 4 Transwell cells detect the migration and invasion ability of SK-hep-1 and MHCC97L

A：MHCC97L細胞株；B：SK-hep-1細胞株.圖5 CCK-8檢測SK-hep-1和MHCC97L肝癌細胞株增殖能力Fig 5 The proliferation capacity of two cell lines was detected by CCK-8

2.6組織芯片免疫組織化學染色 B7-H3蛋白陽性信號定位于胞質及胞膜，呈棕黃色顆粒狀(圖6)。80例中，5例染色脫片，余75例。HCC組織中B7-H3陽性55例(73.33%)，其中29例(38.67%)強陽性，26例(34.67%)弱陽性；41例(54.67%)癌旁組織染色陽性，其中12例(16.00%)強陽性，29例(38.67%)弱陽性。HCC組織B7-H3陽性表達與腫瘤轉移(P=0.007)、分化程度(P=0.012)、復發時間(P=0.001)呈正相關，與腫瘤大小等臨床病理特征無明顯相關性(表1)。

3 討 論

B7-H3是近期發現的免疫球蛋白超家族共刺激分子，由316個氨基酸組成，包含8個外顯子和7個內含子的Ⅰ型跨膜蛋白，在氨基酸端有一信號肽，包括細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)、恒定區(IgC)、跨膜區和45個氨基酸的胞質區。B7-H3分子mRNA可表達于大多數正常組織(如心臟、肝臟、前列腺、睪丸、子宮、胰腺、小腸等)，其蛋白在正常組織中幾乎無表達，但廣泛表達于多種腫瘤組織和細胞[6]。本研究結果顯示，B7-H3在人HCC組織中表達率為73.33%，在癌旁肝組織中表達率為54.67%，多為弱陽性或局灶陽性，與Sun等的研究結果較為一致[7]。

B7-H3屬免疫球蛋白超家族，是使T細胞活化的重要第二信號分子，已成為近年免疫治療中的研究熱點[8]。B7-H3與腫瘤的發生、發展有一定的關系[9]。早期研究多提示，B7-H3與腫瘤發展呈正相關。如在前列腺癌的相關研究中，Zang等研究發現，B7-H3強陽性的患者術后更易發生轉移，術后復發率也更高[10]，且B7-H3的表達促進了前列腺癌細胞惡性表型的發生，增加了腫瘤增殖標志物Ki-67的表達[11]；Bo等研究發現，B7-H3高表達于結直腸癌組織，且與腫瘤T分期呈正相關，結直腸癌細胞過表達B7-H3后增加了癌細胞的侵襲和遷移能力，反之降低了細胞侵襲和遷移能力[12]。然而，近年有研究顯示，B7-H3的表達可能與腫瘤的進展呈負相關，如Wu等研究發現，B7-H3在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度呈負相關，而增強 B7-H3在胃癌細胞中的表達有益于提高患者的生存率[13]。

表1肝癌組織B7-H3表達及與臨床病理特征關系

Tab 1Expression of B7-H3 in liver cancer tissue and its relationship with clinical features

臨床特征nn陽性n陰性χ2P性別 男 女年齡/歲 <60 ≥60d腫塊/cm ≤5 >5ρ術前AFP/(μg·L-1) <20 ≥20肝硬化 無 有分化程度 低 中 高HBV感染 (+) (-)TNM分期 Ⅰ～Ⅱ Ⅲ～Ⅳ復發時間 1年內 1年后轉移 有 無641159162352185710652636136693639453031444874510183715409462225848727284015282716414651531711941151829115153170.6201.2210.4121.2111.6397.3270.1030.09813.9207.7990.4700.3410.5840.3660.2720.0121.0000.7990.0010.007

AFP：甲胎蛋白； HBV：乙型肝炎病毒.

A，B：肝癌組織強陽性表達；C：肝癌組織局灶弱陽性表達；D：癌旁肝組織弱陽性表達.圖6 肝癌及癌旁組織B7-H3免疫組織化學染色(×100)Fig 6 B7-H3 expression in HCC and its adjacent tissues by immunohistochemistry staining(×100)

本研究展開了B7-H3對HCC發生發展關系的研究，通過RNA干擾技術探討下調B7-H3表達對HCC細胞生物學特性的影響，發現下調B7-H3的表達可顯著抑制HCC細胞的侵襲和遷移能力，而對HCC細胞的增殖和凋亡能力無明顯影響，與Li等在胃癌的研究結果一致[14]，但與Wang等報道的B7-H3高表達可促進細胞增殖這一結果不一致[15]，這可能與研究采用的HCC細胞株的來源不同有關。目前已報道的關于B7-H3與HCC關系的研究中，多采用HepG2細胞株進行實驗，該種細胞株是從國外某15歲男孩的原發性肝胚細胞瘤中分離建立的，為人肝母細胞瘤。而本研究采用的MHCC-97L和SK-hep-1細胞株，則屬于內皮細胞來源，其中MHCC-97L來源于我國某39歲男性患者的肝右葉轉移灶，相比于HepG2具有更高的轉移率。在細胞學實驗基礎上，本研究進一步在組織層面探討B7-H3與HCC病情進展的關系，將不同復發時間的HCC組織制作成兩塊組織芯片，并將B7-H3蛋白的表達與HCC的臨床病理特征進行比較，發現B7-H3陽性表達率與HCC的分化程度、復發時間、轉移情況等關系密切，分化程度越低、復發時間越短以及已有轉移的HCC組織，B7-H3的陽性率越高，而B7-H3的陽性率與腫瘤大小無明顯相關性。

本研究從細胞和組織兩個層面得出了一致結果，B7-H3在HCC中發揮著負性調控作用，這與在前列腺癌及結腸癌等發揮的調控作用方向完全相反。B7-H3在不同腫瘤組織中的作用為何會完全相反呢？這可能與B7-H3發揮作用時存在的多種機制有關：如T細胞免疫應答、巨噬細胞M2亞型極化、上皮間質轉化等[16]。在本研究中，B7-H3低表達可降低腫瘤侵襲和遷移能力，提示B7-H3在HCC中可能主要通過上皮間質轉化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)影響腫瘤發展。目前已有研究顯示，在結直腸癌中，B7-H3可通過激活PI3K-Akt途徑而發生EMT，進而增加腫瘤的侵襲遷移能力[17]；Kang等發現，通過JAK-2/Stat-3/Slug通路介導EMT，可提高HCC細胞的侵襲及轉移能力[18]。沉默黑色素瘤患者B7-H3的表達可顯著降低多種腫瘤侵襲、轉移相關蛋白，如白細胞介素-8、基質金屬蛋白酶、信號轉導和轉錄激活因子3等[19]。因此，推測沉默B7-H3表達后對HCC侵襲能力的抑制可能是通過EMT的某種特定信號通路直接實現，具體相關機制仍有待進一步研究，包括動物體內實驗驗證。