mTORC2通路調控CD4+CD25highTreg在糖尿病腎病大鼠中的研究

曾 艷， 趙 青， 周 靜， 李秋月

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發病機制涉及遺傳和血流動力學、高血糖、糖基化、氧化應激、脂質介質和細胞因子信號等方面。最近，T細胞被提出參與了2型DN的發生發展[1]。在2型糖尿病合并微血管病變時，患者的Treg細胞比例明顯下降[2]。mTOR阻斷劑能干擾生長因子、細胞因子等生物活性物質的分泌，調節Treg細胞的增殖[3]。mTOR有兩種復合體：Raptor-mTOR(mTORC1)和Rictor-mTOR(mTORC2)，FK506目前被認為是mTORC1阻斷劑，而ku0063794是mTORC1和mTORC2的雙重阻斷劑。本研究通過觀察兩種mTOR通路阻斷劑對DN大鼠CD4+CD25highTreg的影響，探討Treg在DN中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 健康雄性SD大鼠40只，體質量(250±25)g，清潔級(南昌大學醫學院動物科學部)，許可證號：SYXK(贛)2010-0002。

1.1.2試劑 脲佐菌素(streptozotocin，STZ，北京博愛港公司)，FK506(杭州中美華東公司)，ku0063794(美國Selleck公司)，mTOR抗體(美國Bioworld公司)，Raptor抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，Rictor抗體(美國CST公司)，抗CD4-FITC單抗和抗CD25-PE單抗(美國eBioscience公司)，IL-17和TGF-β1 Elisa 試劑盒(深圳欣博盛生物公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立和分組 40只SD雄性大鼠，隨機選取10只作為A組(對照組)，30只腹腔注射STZ，劑量為55 mg/Kg，以隨機血糖值≥16.7 mmol/L 且穩定5 d為DN造模成功。分為：B組(模型組)、C組(FK506干預組)、D組(ku0063794干預組)。C，D組分別予FK506 1 mg·kg-1·d-1及ku0063794 1 mg·kg-1·d-1灌胃；A，B組予以等量生理鹽水灌胃。

1.2.2mTOR，Raptor，Rictor蛋白半定量檢測 采用Western-blot法檢測，以β-actin為內參。4，8周時，各組隨機選取一半大鼠，開腹游離并取出腎臟，取腎皮質加適量裂解液后勻漿，測定蛋白濃度后，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，轉入PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h。分別加入封閉液稀釋的一抗：兔抗raptor按1∶2 000稀釋，兔抗rictor按1∶1 000稀釋，兔抗mTOR按1∶800稀釋。4 ℃過夜。TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育后，ECL顯影、曝光，用凝膠成像分析系統成像，掃描灰度值，進行半定量分析。

1.2.3腎臟病理檢查 8周時取腎組織，石蠟切片脫蠟水化后行蘇木精-伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining，H-E)、過碘酸六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)染色，光學顯微鏡下觀察腎組織病理改變并拍照，用BI2000圖像系統分析，進行腎臟病理評分[4]。

1.2.3.1腎小球病理評分

1.2.3.1.1系膜細胞增殖 按無、輕、中、重度增殖分別記0，1，2，3分。

1.2.3.1.2基質增寬 正常記0分；輕度變化毛細血管袢無明顯影響記1分；中度變化呈彌漫性增寬，50%以下毛細血管袢狹窄閉鎖記2分；重度變化呈彌漫性增寬，50%以上毛細血管袢狹窄閉鎖記3分。

在知識經濟背景下，人力資源已經成為企業發展的核心。目前，我國通信行業還處于初級的發展水平，因而在諸多方面還不是十分的完善。其中，人力資源管理中，薪酬分配制度缺乏合理性就是重要的體現。現階段，我國大部分通信公司在薪酬分配過程中，采用的分配體系都是依托崗位技能為主的等級薪酬制。顯然，這種傳統的薪酬分配制度難以滿足員工的需求。因此，通信行業人力資源管理中薪酬分配制度必須要不斷完善。

1.2.3.1.3硬化改變 正常記0分；局灶節段分布，硬化腎小球<30%記1分；30%～60%記2分；>60%記3分。

1.2.3.1.4新月體形成 正常記0分；局灶節段分布<25%記1分；彌漫性節段分布30%～50%記2分；彌漫灶狀分布>50%記3分。

1.2.3.2腎小管間質病理評分

1.2.3.2.1腎小管變性、壞死 按無、輕、中、重度受損分別記0，1，2，3分。

1.2.3.2.2腎小管萎縮 按無、小灶狀、片灶狀、彌漫性重度分別記0，1，2，3分。

1.2.3.2.3間質炎癥細胞浸潤 按無、小灶狀、片灶狀、彌漫性重度分別記0，1，2，3分。

1.2.3.2.4間質纖維化 按無、小灶狀、片灶狀、彌漫性重度分別記0，1，2，3分。

1.2.3.3病理總評分 病理總評分=腎小球評分+腎小管評分，總分最多為24分。

1.2.4血IL-17及TGF-β1檢測 酶標包被板，設置空白孔、標準孔、待測樣本孔；空白孔加樣品稀釋液100 μL、標準孔加標準品100 μL、待測樣本孔加待測樣品100 μL；37 ℃覆膜孵育90 min；棄去孔內液體，甩干，洗板5次；每孔加HRP Conjugate工作液100 μL，37 ℃覆膜溫育30 min；甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μL，37 ℃覆膜避光孵育15 min，加終止液50 μL終止反應；用450 nm波長測量各孔的吸光值(OD值)，根據標準品濃度及其對應的OD值，計算標準曲線直線回歸方程，再根據樣本OD值，用回歸方程計得出對應的樣品濃度，最終濃度用實際測定濃度與稀釋倍數相乘。

1.2.5血CD4+CD25highTreg百分比檢測 血液加等量PBS液使之充分混勻后，加入淋巴分離液，離心后毛細吸管吸取上中層界面處的細胞，再次加入PBS液，離心后取管底細胞，重復2次，調整單個核細胞濃度至(1～2)×105L-1。抗CD4-FITC單抗和抗CD25-PE單抗各1 μL分別加入試管，鼠IgG2a、鼠IgG1各1 μL分別加入同型對照管，混勻避光孵育30 min，PBS洗滌離心后棄上清液，采用美國BDFACSCalibur型流式細胞儀檢測血CD4+CD25highTreg的百分比。

2 結 果

2.1腎組織的mTOR，Raptor，Rictor蛋白水平檢測 4，8周時，B組的mTOR較A組明顯升高(P<0.05)，C組干預4周后下降，低于B組(P<0.05)；8周時C，D組均明顯低于B組(P<0.001)，C，D組間比較差別無統計學意義(P>0.05)；4，8周時，B組的Raptor較A組明顯升高(P<0.05)，C，D組均低于B組(P<0.05)，C，D組間比較差別無統計學意義(P>0.05)；4，8周時 B組Rictor較A組明顯升高(P<0.05)，4周時C，D組下降低于B組(P<0.05)，8周時進一步下降，與A組比較，差別有統計學意義(P>0.05)，C，D組間比較差別無統計學意義(P>0.05，圖1)。

2.2血CD4+CD25highTreg百分比檢測 4，8周時，B組CD4+CD25highTreg明顯低于A組(P<0.05)，C，D組干預4周后CD4+CD25highTreg逐步回升，高于B組(P<0.05)；8周時進一步升高，均高于4周時(P<0.05)；C，D組間比較差別無統計學意義(P>0.05，圖2，3)。

2.3血TGF-β1和IL-17檢測 4，8周時，B組TGF-β1明顯高于A組(P<0.05)，干預后指標下降，C組低于D組(P<0.05)；4，8周時，B組IL-17明顯高于A組(P<0.05)，干預后指標下降，C，D組均低于B組(P<0.05，圖4)。

2.4病理評分 光鏡下B組大鼠系膜細胞及基質彌漫增生，部分毛細血管擴張，呈分葉狀，基底膜增厚，部分腎小管上皮腫脹，腎小管萎縮，間質炎性細胞浸潤，部分纖維化。B，C，D組大鼠病理評分均高于A組(P<0.05)，C，D組病理評分低于B組(P<0.05)；C，D組間比較，差別無統計學意義(P>0.05，圖5，6)。

A：對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組. 與A組同時間點比較，○：P<0.05；與B組同時間點比較，●：P<0.05.圖1 DN大鼠腎組織mTOR, Raptor及Rictor蛋白的表達Fig 1 Expression of mTOR, Raptor and Rictor proteins in diabetic nephropathy rats

A：對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組. 與A組同時間點比較，○：P<0.05；與B組同時間點比較，●：P<0.05；與B組0周比較，△：P<0.05；與D組4周比較，▲：P<0.05；與C組4周比較，☆：P<0.05.圖2 DN大鼠CD4+CD25high TregFig 2 CD4+CD25high Treg in diabetic nephropathy rats

2.5相關性分析 8周時，B組大鼠的Rictor與CD4+CD25highTreg及Ccr呈負相關(P<0.05)，與TGF-β1，IL-17及尿蛋白、病理評分呈正相關(P<0.05)；Raptor與尿蛋白和病理評分呈正相關(P<0.05)，與Ccr呈負相關(P<0.05)，與CD4+CD25highTreg，TGF-β1及IL-17均無相關性(P>0.05)。

3 討 論

在腎小球疾病，短期的mTOR通路的激活是有積極影響的，但是長時間激活導致蛋白尿和腎小球硬化。在非常早期的DN中，mTORC1靶基因的表達增加[5]，下調足細胞mTORC1表達能阻止腎小球硬化，在足細胞病大鼠中敲除Raptor會很快導致蛋白尿、腎小球硬化的發展、足突的融合和消失[6]，而敲除Rictor短期內足細胞無明顯變化；但若同時敲除Raptor和Rictor會導致大鼠腎功能迅速衰減甚至死亡，由此推測在糖尿病足細胞病中mTORC1和mTORC2兩條通路都起重要作用。筆者的前期研究已發現，Rictor與DN大鼠足細胞Ezrin及α-SMA蛋白的表達相關[7]。本研究中，分別給予FK506和ku0063794兩種mTOR阻斷劑，FK506組起效比ku0063794組快，在4周時即下調了mTOR的表達；兩干預組對Rictor蛋白的調控均有效，且有時效性，8周時較4周時下降更明顯，兩組間差別無統計學意義，提示FK506也有可能通過延長作用時間阻斷Rictor-mTOR通路。

mTOR通路阻斷劑能顯著增強腎臟Treg細胞的擴張，提升Treg細胞和巨噬細胞的數量，增加抗炎細胞因子的表達，抑制常規T細胞、骨髓細胞、肌成纖維細胞，改善腎功能和減少腎臟纖維化[8]。本研究中，FK506和ku0063794干預組均可增加CD4+CD25+Treg細胞的數量，給藥時間長也使效果更明顯。CD4+CD25+Treg細胞可分泌IL-4，IL-7及TGF-β等多種細胞因子，TGF-β參與足細胞向間質細胞轉分化，加重細胞外基質的沉積，促進足細胞凋亡，腎臟以TGF-β1表達最多且活性最高[9]，TGF-β1在DN早期可降低血糖、減輕腎臟肥大、減輕氧化應激、維持STAT3活化，致Treg/Th17平衡，在改善代謝紊亂和延緩DN腎臟損傷方面有保護作用[10]，但TGF-β1表達過度會加重腎臟損傷。Treg細胞通過分泌TGF-β促進Th17細胞發育、成熟，Th17是促炎性細胞，可分泌TNF-α，IL-6及IL-17等參與炎癥反應[11]，進一步放大體內炎癥效應，是自身免疫性疾病的致病效應性細胞。尤其是IL-17，它能抑制足細胞Podocalyxin的表達，導致腎小球基底膜的電荷屏障受損，促進大量蛋白尿的形成[12]，還可以促進足細胞凋亡，這一作用且呈濃度、時間依賴性。

DN：糖尿病腎病. A：空白對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組.圖3 DN大鼠CD4+CD25high Treg在各時間點的變化Fig 3 Changes of CD4+CD25high Treg in DN rats at various time points

DN：糖尿病腎病; TGF:腫瘤生長因子. A：對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組. 與A組同時間點比較，○：P<0.05；與B組同時間點比較，●：P<0.05；與C組同時間點比較，△：P<0.05；與D組4周比較，▲：P<0.05.圖4 DN大鼠TGF-β1和IL-17檢測結果Fig 4 TGF-β1 and IL-17 in DN rats

DN：糖尿病腎病. A：對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組. 與A組同時間點比較，○：P<0.05；與B組同時間點比較，●：P<0.05.圖5 DN大鼠腎臟病理評分Fig 5 Kidney pathology score in DN rats

DN：糖尿病腎病. A：對照組；B：模型組；C：FK506干預組；D：ku0063794干預組.圖6 8周時DN大鼠腎組織病理(PASM染色 ×400)Fig 6 Renal tissue pathology of DN rats at 8 weeks (PASM staining ×400)

本研究中，模型組大鼠的TGF-β1高表達，給予mTOR阻斷劑后表達下調，提示mTOR通路阻斷劑可能通過減少CD4+CD25+Treg細胞，下調TGF-β等多種細胞因子，從而減少Th17細胞分泌IL-17等炎癥因子，減輕腎臟損傷。Rictor與CD4+CD25+Treg呈負相關，與TGF-β和IL-17呈正相關；Raptor與CD4+CD25+Treg，TGF-β和IL-17均無相關性，提示CD4+CD25+Treg可能受Rictor-mTOR通路調控。后續將運用體外試驗進一步證實Treg/Th17平衡受Rictor-mTOR通路調控，為DN的治療提供新的靶點。