CXCR4基因沉默對膀胱癌T24細胞增殖和凋亡及遷移能力的影響

陳 爍， 龔銀銀， 顏景穎， 汪慧敏， 冉 云， 張 濤

在我國，膀胱癌的發病率位居惡性腫瘤的第5位，位居男性泌尿生殖系統惡性腫瘤的第1位，且復發率高達50%～70%[1]。因此，探討膀胱癌發生發展的分子機制，尋找可靠的生物學標志物和有效的基因治療靶點，對提高膀胱癌患者的生存率顯得尤為重要[2]。研究認為，CXCR4基因與多種惡性腫瘤的發生發展關系密切[3-4]。本研究擬通過RNA干擾技術下調CXCR4基因的表達水平，觀察CXCR4基因表達下調對膀胱癌T24細胞增殖、凋亡、遷移功能方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細胞株(中國典型培養物保藏中心)；兔抗人CXCR4抗體(美國R&D公司)；轉染脂質體Lipofectamin 2000(美國Invitrogen公司)；RPMI 1640細胞培養液及胰蛋白酶(美國Gibco公司)；10%的胎牛血清(杭州四季青公司)；噻唑藍(MTT)(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Costar公司)；Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒液由中山大學附屬第一醫院胃腸外科王天寶教授饋贈。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染分組 在無菌條件下，將人膀胱移行細胞癌T24細胞株置于含有10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素+青霉素)的RPMI 1640培養液中培養，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。轉染前1天，把處于對數生長期的T24細胞以每孔5×105個的密度接種在6孔板中；次日，當T24細胞濃度達50%～70%時進行轉染實驗。將T24細胞分為3組：(1)干擾組，應用陽離子脂質載體Lipofectamine 2000將小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染入T24細胞，轉染5 h后，更換含血清及抗生素的培養液再繼續培養；(2)陰性對照組，將轉染siRNA空載體作為陰性對照組；(3)空白對照組，不進行任何處理。

1.2.2Western-blot檢則 取80 μg蛋白質樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫下封閉1 h，加入用0.05%的Tween 20 TBS緩沖液稀釋的CXCR4蛋白抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，再用TBS緩沖液漂洗3次，加入用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)中，37 ℃下溫育1 h，采用增強化學發光系統顯色和拍照。采用相關軟件分析各條帶光密度值。實驗重復3次，取均數作為該蛋白質的表達含量。

1.2.3檢測細胞的死亡率 取對數生長期細胞，調整濃度為1×105mL-1，接種于24孔培養板中，分別于轉染24,48及72 h后收取細胞，3 200 r/min離心3 min，以適量體積重懸，用0.04%臺盼藍溶液與等體積細胞懸液混勻3 min，計數活細胞和死細胞。

細胞死亡率(%)=死細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%

1.2.4細胞增殖檢測 (1)細胞增殖實驗：將密度為2×105mL-1的T24細胞移到96孔板中培養，每孔加入100 μL的RPMI 1640培養基(含10% FBS)，于37 ℃水浴孵育5 min或室溫放置25 min。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育2 h。分別于CCK-8溶液加入后的0，24，48和72 h測定不同處理的T24細胞的光密度值，并進行統計學分析。(2)細胞凋亡檢測：將T24細胞以每孔1×105mL-1的密度種植于6孔板中，加入無血清DMEM培養基，于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中孵育24 h，收集細胞，1 000 r/min下離心5 min，PBS清洗2次，Binding Buffer清洗1次，1 000 r/min下離心5 min。Binding Buffer 500 μL重懸細胞，避光加入5 μL Annexin V，室溫避光作用15 min。加入5 μL 7-氨基放線菌素D(7-amino-actinomycin D,7-AAD)，1 h內用流式細胞儀檢測。

1.2.5Transwell小室侵襲實驗 取100 μL T24細胞懸液加入到Transwell小室，下室加入500 μL的10% FBS培養基，再放入37 ℃培養箱內繼續培養。連續培養48 h，觀察細胞遷移情況。將Transwell小室取出，用棉棒將上室內的明膠基質擦去，用PBS清洗3遍，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，再用PBS溶液清洗干凈后，用0.1%結晶紫染色30 min，用PBS液清洗，吹干。顯微鏡隨機挑選10個視野進行細胞計數，取平均值。

2 結 果

2.1siRNA干擾對T24細胞中CXCR4蛋白表達的影響 轉染72 h后，Western-blot檢測結果顯示，3組細胞均不同程度表達CXCR4，干擾組明顯低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01，圖1)。

A：Western-blot檢測3組CXCR4蛋白的電泳圖譜,1,2,3分別為空白對照組、陰性對照組及干擾組；B：3組T24細胞CXCR4蛋白的相對表達量，與其他兩組比較，☆☆：P<0.01.圖1 siRNA干擾對T24細胞中CXCR4蛋白表達的影響Fig 1 Expression of CXCR4 on T24 cells after siRNA interference

2.2siRNA 干擾對T24細胞死亡的影響 轉染siRNA后24，48和72 h后，干擾組的T24細胞死亡率高于空白對照組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較，差別則無統計學意義(表1)。

表1CXCR4基因沉默后不同時間T24細胞死亡率的變化

Tab 1Rate of cell death on T24 cell at different times after silencing of CXCR4 gene

分 組t轉染/h244872空白對照組2.312±0.6513.205±0.4574.431±0.983陰性對照組2.293±0.4824.212±0.4845.589±0.616干擾組4.805±0.711#15.568±0.913#40.146±2.152☆

n=3. 表中數據為%. 與空白對照組比較，☆：P<0.05.

2.3siRNA干擾后對T24細胞增殖的影響 轉染siRNA 24，48和72 h后，陰性對照組、空白對照組和干擾組的膀胱癌細胞系增殖速率分別為[(0.99±0.4)，(0.98±0.4)，(0.65±0.2)；(2.36±0.4)，(2.28±0.4)，(1.32±0.3)；(3.59±0.2)，(3.39±0.3)，(1.83±0.4)]，3組在各個時間點的差別均具有統計學意義(P<0.05，圖2)。

3組細胞在各個時間點比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.001.圖2 轉染siRNA后抑制膀胱癌T24細胞系的增殖Fig 2 The proliferation of T24 bladder cancer cells after siRNA transfection

2.4siRNA干擾后對T24細胞凋亡的影響 干擾組的凋亡率為(63.66±5.7)%，與空白對照組和陰性對照組比較[(18.4±2.6)%，(20.2±3.1)%]，差別均有統計學意義(P<0.01，圖3)。

A：空白對照組； B：陰性對照組； C：干擾組.圖3 雙染法流式細胞術分析各組細胞的凋亡率Fig 3 Apoptosis rate of different groups

2.5siRNA干擾后對膀胱癌T24細胞遷移侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗顯示，每高倍鏡視野下，干擾組的細胞數目顯著低于陰性對照組和空白對照組(圖4A～C)。T24細胞空白對照組(234.6±23.4)個、陰性對照組(210.7±20.9)個，明顯高于干擾組的(84.9±17.5)個，差別具有統計學意義(P<0.05，圖4D)。

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：干擾組；D：統計柱狀圖. 與其他兩組比較，☆☆：P<0.01.圖4 Transwell實驗分析siRNA對T24腫瘤細胞侵襲的影響Fig 4 Cell invasion of siRNA on T24 bladder cancer cell

3 討 論

膀胱癌的發生發展是多因素、多階段的綜合過程。趨化因子家族因其為刺激新血管形成提供關鍵信號，以及促成細胞成熟和調節細胞分化和凋亡的特殊功能，目前已成為膀胱癌基因新的研究熱點[5]。趨化因子CXCL12是趨化因子CXC家族中的一員，又名基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)，是一種造血過程和骨髓移植術后骨髓基質細胞產生的細胞因子，是T細胞和單核細胞的趨化因子，在肺、肝、骨髓和淋巴結等器官中高表達[6]。國內外研究發現，腫瘤組織的基質中含有大量CXCL12，并且在部分腫瘤細胞株中可以檢測到CXCL12的表達[7]。CXCR4是目前唯一已知的CXCL12受體，介導CXCL12的趨化作用。當前普遍認為，CXCR4的表達是惡性腫瘤的一個重要特征，可作為判斷預后的重要指標之一[8]。進一步的研究發現，CXCL12/CXCR4對胚胎發育和腫瘤轉移具有重要作用[9-11]。Guembarovski等發現，CXCL12/CXCR4系統在乳腺癌的轉移過程中具有明顯作用，表達CXCR4的腫瘤細胞可以在CXCL12的趨化影響下向周圍或遠端組織侵襲并形成轉移灶[12]。此外，CXCR4在骨肉瘤和肺癌中表達升高[13-14]。Akashi等采用免疫組織化學法檢測前列腺癌組織，結果發現，CXCR4蛋白表達升高與腫瘤的轉移正相關[15]。筆者在前期的研究中也發現，CXCL12能夠促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲，抑制其受體CXCR4表達后，可逆轉CXCL12對骨肉瘤遷移和侵襲的促進作用，表明CXCR4基因對骨肉瘤的侵襲和遷移起重要調節作用[16]。

近年來，國內外學者發現，CXCR4基因也可能在膀胱癌的發生發展和轉移中起重要作用。葉明寶等檢測了118例膀胱癌組織和癌旁組織標本的SDF-1/CXCR4、PD-L1/PD-1以及細胞凋亡相關分子、細胞侵襲相關分子的表達量，結果發現，SDF-1/CXCR4與負性共刺激分子PD-L1、促增殖分子、促侵襲分子的高表達密切相關，SDF-1/CXCR4能夠促進膀胱癌細胞的免疫逃逸、增殖以及侵襲[17]。此外，鄭湘予等發現，CXCR4 siRNA能抑制人膀胱癌T24細胞株裸鼠皮下移植瘤的形成[18]，但未檢測CXCR4基因沉默后對人膀胱癌T24細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。杜岳峰等構建人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動子調控的CXCR4短發夾RNA逆轉錄病毒表達載體，并研究其對hTERT陽性膀胱癌細胞中CXCR4表達的抑制效應以及對細胞侵襲、增殖的影響，但只限于hTERT陽性膀胱癌細胞[19]。

本研究發現，轉染siRNA后，T24細胞中的CXCR4蛋白表達明顯下調，同時還促進T24細胞的凋亡，抑制T24細胞的增殖，并顯著降低T24細胞的遷移能力，表明下調CXCR4基因可能抑制膀胱癌細胞的增殖及轉移，沉默CXCR4基因可能是新的膀胱癌治療靶點。