丹參酮ⅡA對(duì)大鼠心肌梗死后心房顫動(dòng)易感性的影響

馬 金丁春華張敏州

5%～23%的心肌梗死(myocardial infarction，MI)病人可伴發(fā)心房顫動(dòng)。Framingham心臟中心研究顯示，MI合并心力衰竭可使女性病人心房顫動(dòng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加4.5倍，男性病人心房顫動(dòng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加5.9倍[1]。近年來，心房纖維化作為心房顫動(dòng)的重要發(fā)病機(jī)制之一，在心房顫動(dòng)中的作用越來越受到重視[2]。MI后由于交感神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)期過度興奮，腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，心臟局部和血液血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)水平升高，均可導(dǎo)致心房纖維化及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而使心房顫動(dòng)易于發(fā)生[3]。

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)具有多種心血管藥理活性，可降低心肌缺血再灌注損傷所致的心律失常， Tan ⅡA注射液可減少急性心肌梗死并發(fā)心房顫動(dòng)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tan ⅡA具有抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和彈力蛋白的沉積，減少纖維化的作用[3-4]。Tan ⅡA是否通過抑制心房纖維化防治MI后心房顫動(dòng)尚不清楚。本研究利用大鼠MI模型，采用經(jīng)食管高頻起搏左房技術(shù)檢測(cè)心房顫動(dòng)的誘發(fā)率，明確Tan ⅡA是否具有降低MI后心房顫動(dòng)誘發(fā)率的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Tan ⅡA購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)公司；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 主要儀器 PowerLab型多導(dǎo)生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞ADinstruments公司；ISO-Flex型電生理刺激隔離器，以色列AMPI公司；Vevo2100型動(dòng)物超高分辨率超聲系統(tǒng)，加拿大VisualSonic公司；Epoch型微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)Biotek儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重250～280 g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2011-0029，大鼠專用飼料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)方法和步驟均符合實(shí)驗(yàn)守則和倫理委員會(huì)的要求。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死組(MI組)和丹參酮ⅡA組(Tan ⅡA組)。由于大鼠MI模型初始1周死亡率較高，所以30只造模，10只死亡，造模1周后將存活的20只大鼠隨機(jī)分為MI組和TanⅡA組。Sham組由于未造模，死亡率為0，最終30只大鼠存活納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 大鼠MI模型制備 MI模型采用左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)結(jié)扎制備[5]：大鼠麻醉后無創(chuàng)氣管插管連接呼吸機(jī)，開胸暴露心臟，將LAD結(jié)扎。通過肉眼觀察(顏色變蒼白)和心電圖監(jiān)測(cè)(ST段抬高和QRS增寬)證實(shí)結(jié)扎成功。MI術(shù)后1周大鼠經(jīng)動(dòng)物超聲檢查左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，將LVEF<45%的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，作為MI并發(fā)心力衰竭模型(其余排除本實(shí)驗(yàn))。Sham組接受同樣的手術(shù)過程，但LAD只穿線不結(jié)扎。Tan ⅡA組大鼠灌胃Tan ⅡA 70 mg/(kg·d)，Sham組、MI組給予等體積的0.5%羥甲纖維素替代，共給藥4周。

1.5 心房顫動(dòng)誘發(fā)率及持續(xù)時(shí)間的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[5-6]，采用經(jīng)食管高頻起搏左心房方法誘發(fā)心房顫動(dòng)。大鼠麻醉后固定，連接四肢監(jiān)測(cè)心電。無創(chuàng)氣管插管并連接呼吸機(jī)人工通氣，通過食管插入4F四極電極至左心房后壁處，經(jīng)食管導(dǎo)聯(lián)心電圖調(diào)整電極深度，待出現(xiàn)負(fù)正雙相P波時(shí)，將導(dǎo)線連接電生理刺激隔離器，測(cè)定起搏閾值，起搏電流以2倍起搏閾值電流，確認(rèn)1∶1起搏后予以固定。心房顫動(dòng)誘發(fā)電刺激方案：經(jīng)食管電極發(fā)放S1，S1刺激35 s，起搏間期5 ms，觀察心房顫動(dòng)誘發(fā)情況。以心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間≥2 s作為誘發(fā)成功標(biāo)志；若未誘發(fā)出心房顫動(dòng)，則重復(fù)刺激2次；若仍未成功，起搏電流依次遞增2次，每個(gè)強(qiáng)度均重復(fù)3次，仍未誘出者，視為心房顫動(dòng)誘發(fā)不成功。分析心房顫動(dòng)誘發(fā)率和心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間的變化。

1.6 羥脯氨酸含量檢測(cè) 取左心房組織，按照羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說明書步驟操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組上清液550 nm處吸光度值。

1.7 組織病理學(xué)觀察 心臟多聚甲醛固定后，沿心底到心尖部取心臟縱切面4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，采用Masson染色方法，心肌纖維染色呈綠色，間質(zhì)膠原呈紅色。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，用圖像分析軟件分析測(cè)定心肌纖維化面積百分比(膠原面積÷心肌總面積×100%)，可反映心房間質(zhì)纖維化程度。

1.8 Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1蛋白含量檢測(cè) 采用Western Blot檢測(cè)左心房Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1含量。具體步驟如下：加入預(yù)冷的含cocktail蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA，CST)在液氮內(nèi)研磨制成勻漿，12 000 r/min離心30 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取50 μg總蛋白樣品于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，用5%脫脂牛奶封閉后，用Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1相應(yīng)抗體1∶1 000，4 ℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育40 min，顯色。GAPDH(1∶1 000)作為內(nèi)參，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝片。采用Image J 軟件分析蛋白條帶，以目的條帶和GAPDH條帶灰度值之比評(píng)價(jià)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 心房顫動(dòng)誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間 經(jīng)食管高頻起搏左心房方法誘導(dǎo)心房顫動(dòng)，圖1 A為典型的誘發(fā)心房顫動(dòng)心電圖，電刺激前為竇性心律；電刺激結(jié)束后心電圖P波消失，代之f波，RR間期絕對(duì)不等，誘發(fā)出心房顫動(dòng)；經(jīng)過若干秒后，心房顫動(dòng)自發(fā)轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律并維持。MI組發(fā)生心房顫動(dòng)11例，心房顫動(dòng)誘發(fā)率73.3%(11/15)，Sham組未誘發(fā)出心房顫動(dòng)(0/15)。Tan ⅡA組心房顫動(dòng)誘發(fā)率為46.7%(7/15)，低于MI組的73.3%，詳見圖1 B。Tan ⅡA組心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間為62～238 s，短于MI組(397～656 s)，詳見圖1 C。

圖1 經(jīng)食管高頻起搏左心房方法檢測(cè)心房顫動(dòng)易感性

2.2 心房病理學(xué)觀察結(jié)果 Masson染色檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞染成綠色，間質(zhì)膠原蛋白染成紅色。MI組間質(zhì)紅色膠原蛋白區(qū)域較Sham組明顯增加，其心肌纖維化面積百分比可達(dá)9.5%；Sham組未見明顯的紅色膠原蛋白區(qū)域。Tan ⅡA組纖維化區(qū)域相對(duì)于MI組縮小，其纖維化面積較MI組顯著降低。詳見圖2。

圖2 Masson染色檢測(cè)左心房纖維化情況(×200)

與Sham組比較，＊P<0.05；與MI組比較，#P<0.05

2.3 心房羥脯氨酸含量 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，MI組左心房羥脯氨酸含量顯著高于Sham組(P<0.05)，Tan ⅡA組羥脯氨酸含量低于MI組(P<0.05)。詳見圖3。

與Sham組比較，＊P<0.05；與MI組比較，#P<0.05

2.4 心房膠原蛋白含量 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MI組左心房Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量高于Sham組(P<0.05)，Tan ⅡA組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量低于MI組(P<0.05)。詳見圖4。

與Sham組比較，＊P<0.05；與MI組比較，#P<0.05

2.5 心房MMP-9、TIMP-1蛋白含量 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MI組左心房MMP-9蛋白含量高于Sham組(P<0.05)，TIMP-1蛋白含量低于Sham組(P<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值增大。Tan ⅡA組MMP-9蛋白含量下調(diào)，低于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TIMP-1蛋白含量上調(diào)，高于于MI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Tan ⅡA組MMP-9/TIMP-1比值下降，低于MI組。詳見圖5。

與Sham組比較，*P<0.05；與MI組比較，#P<0.05

3 討 論

Tan ⅡA是中藥丹參的主要有效成分，其磺化劑注射液現(xiàn)已廣泛用于心絞痛、腦卒中、腫瘤、肝纖維化等多種疾病的臨床治療[6]。近些年關(guān)于Tan ⅡA抑制心室重構(gòu)進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為其對(duì)多種心血管疾病所致心室重構(gòu)均有一定治療作用，機(jī)制包括：改善心肌肥大，減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積及改善心臟神經(jīng)重構(gòu)和電生理異常等。劉莉娟等[7]報(bào)道胺碘酮聯(lián)合丹參酮ⅡA磺酸鈉治療MI并發(fā)心房顫動(dòng)效果顯著。本研究采用大鼠MI模型，造模1周后給藥避免了藥物對(duì)MI急性期的保護(hù)作用，單獨(dú)研究藥物對(duì)MI慢性期作用，證實(shí)Tan ⅡA具有抑制MI后左心房纖維化并降低心房顫動(dòng)易感性的作用。

心肌纖維化是臨床多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的必然過程[8-9]。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)大鼠MI慢性期存在明顯的左房纖維化，大鼠MI 10周后左房纖維化面積較對(duì)照組增加近10倍。心房纖維化是導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)、電傳導(dǎo)及興奮性改變，引起及維持心房顫動(dòng)的充分條件[11]。心房纖維化開始于基礎(chǔ)疾病早期并一直持續(xù)發(fā)生，導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)改變。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，具有抗纖維化作用的藥物吡格列酮、白藜蘆醇等均可減少心房纖維化，改善心房電傳導(dǎo)功能，有效降低心房顫動(dòng)發(fā)生[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI組左心房膠原纖維化面積及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量明顯高于Sham組，并伴有心房顫動(dòng)誘發(fā)率和心房顫動(dòng)持續(xù)時(shí)間明顯增高，Tan ⅡA組左心房膠原纖維化面積較MI組減少，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量較MI組降低，證明Tan ⅡA具有抑制心房纖維化作用，并降低心肌梗死大鼠心房顫動(dòng)誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間，證明Tan ⅡA可有效降低MI后心房顫動(dòng)易感性。

生理情況下，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成和降解處于動(dòng)態(tài)平衡。各種因素引起生成和降解失衡，導(dǎo)致ECM聚集是心肌纖維化的重要機(jī)制[14]。MMPs是唯一能降解心肌間質(zhì)膠原的一類鋅依賴蛋白酶，TIMPs是內(nèi)源性MMPs抑制劑，MMPs選擇性地消化分解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分，與TIMPs二者相互作用保持相對(duì)平衡，控制調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)組織膠原的生成代謝和更新[15]。MMP-9/TIMP-1在該過程中發(fā)揮重要作用。有研究證明，心肌纖維化過程伴有MMP-9/TIMP-1活性或表達(dá)異常[16]。兩者決定心臟基質(zhì)合成與降解的平衡，在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性方面起重要作用[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，左心房MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，TIMP-1蛋白表達(dá)下調(diào)，MMP-9/TIMP-1比值升高，這與既往研究結(jié)果[18-19]一致。Tan ⅡA組給藥4周后，左心房MMP-9蛋白表達(dá)較MI組降低，TIMP-1蛋白表達(dá)量較MI組升高，MMP-9/TIMP-1比值較MI組降低，心房纖維蛋白量降低。因此，推測(cè)Tan ⅡA減輕心房細(xì)胞外間質(zhì)纖維化作用，與MMP-9/TIMP-1表達(dá)平衡有關(guān)，可能通過影響MMP-9和TIMP-1表達(dá)，是兩者表達(dá)平衡減輕心肌細(xì)胞外間質(zhì)重構(gòu)。

綜上所述，Tan ⅡA具有抑制心房纖維化并降低心肌梗死后心房顫動(dòng)易感性的作用，這可能與Tan ⅡA具有調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1平衡作用有關(guān)。