中華鱉GnRH 1基因cDNA克隆及表達特征

申 慧，張英萍，王利華，沙 航，王詠星，鄒桂偉，梁宏偉

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；3.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘腦分泌的，動物生殖過程中最重要的激素之一，在脊椎動物的性腺發育、繁殖功能維持中起著重要的作用。它是下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸的關鍵信息分子；由下丘腦接收的信息以間歇性脈沖的形式來分泌GnRH，從而刺激垂體前葉分泌促性腺激素(Gonadotropin,GTH)，即促卵泡素(follocle-stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH)，進而促進睪丸或卵巢的發育并分泌睪酮(testosterone,T)或雌二醇(estrogen,E2)，從而調節性激素的分泌[1]，調控性腺影響配子的發育與成熟[2-3]。脊椎動物中大多數物種至少存在兩種促性腺激素釋放激素，硬骨魚中一般存在3種類型的促性腺激素釋放激素。促性腺激素釋放激素來源和定位的不同，也造成了不同類型促性腺激素釋放激素在功能方面的差異。脊椎動物具有多個GnRH亞型，分為三個主要組分，即GnRH1、GnRH2和GnRH3[4]。一般認為存在于下丘腦的組織特異性GnRH為GnRH1，即sbGnRH，主要作用是刺激促性腺激素的釋放。GnRH2在結構上高度保守，包含由中腦神經元表達的所有GnRH形式，主要調節性行為和攝食行為。GnRH3目前只在硬骨魚中被發現，由位于腹側前腦的神經元表達，且已被證明其發揮神經調節功能[5-6]。

中華鱉(Pelodiscussinensis)作為我國重要的水產名優經濟動物,2016年全國的養殖產量約34.5萬噸，已成為我國漁業結構優化、農民增收致富的重要養殖對象之一[7-8]。中華鱉養殖業快速發展的同時，由于養殖戶的盲目引種、不科學的配組繁殖，使得中華鱉生長速度減慢、群體整齊度降低和畸形率增加，嚴重制約其產業的發展[9]。中華鱉屬于分批產卵的卵生爬行動物，相比較魚來說，產卵量少，繁殖效率較低，因此對其繁殖機理的研究不僅有利于改善其繁殖性能，也有利于中華鱉新品系(種)的培育。本試驗以中華鱉GnRH1基因為研究對象，對其在不同性別、不同組織和胚胎發育過程中的表達特征進行分析，為今后GnRH基因在中華鱉生殖調控等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用中華鱉收集自安徽省喜佳農業發展有限公司，選取健康且活力好的1齡中華鱉雌雄個體各3只，其中雄性(395.36±20.55)g，雌性(283.72±18.02)g，活體經麻醉后，解剖采集腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、肌肉、腸、卵巢或精巢等8組織樣品；參照Tokita等[10]對中華鱉胚胎發育過程的分期，選取30 ℃孵化條件下中華鱉發育的第8期、第10期至第18期共10個時期的胚胎，每時期均取3個重復樣本；樣品于液氮罐中保存過夜后轉至-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

取保存的雄性中華鱉腦組織，根據Trizol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白定量儀(Nanodrop 2000 Thermo Scientific，美國)檢測提取的RNA濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)合成cDNA，同時使用SMARTerTMRACE 5′、3′ Kit(TaKaRa，大連)分別合成5′、3′ RACE cDNA模板，-20 ℃保存。

1.3 中華鱉GnRH 1基因全長cDNA的克隆

根據GenBank中華鱉GnRH1基因mRNA預測序列(XM_014569063.2)，設計克隆GnRH1基因中間片段引物(表1)。PCR體系參考PCR Master Mix試劑說明書(20 μL)，反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環；72 ℃ 3 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。根據獲得的GnRH1基因中間序列設計用于5′ 和3′ RACE擴增的引物(表1)。3′ RACE采用引物GnRH1-3′ outer和試劑盒提供的接頭引物3′ adapter進行第一輪PCR擴增，接著以引物GnRH1-3′ inner和3′ adapter進行巢式PCR二輪擴增。5′ RACE采用引物GnRH1-5′ outer和試劑盒接頭引物5′ adapter以加尾的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增，然后以GnRH1-5′ inner引物和5′ adapter進行巢式PCR第二輪擴增。PCR目的條帶純化回收后連接到pUC-19T載體，后轉化至DH5α感受態細胞中培養，挑取陽性克隆送至武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。

1.4 中華鱉GnRH 1基因全長及序列分析

將克隆得到的片段通過DNAMAN軟件進行拼接，并用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.n ih.gov/o-rffinder/)在線工具預測基因的開放閱讀框(ORF)位置；然后利用Expasy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)將其翻譯為氨基酸序列并預測蛋白的相對分子質量和等電點；采用在線工具SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Sign-alP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對其信號肽以及跨膜區進行預測；利用Net-Phos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測氨基酸功能位點；使用DNAMAN軟件對中華鱉GnRH1及其同源氨基酸序列進行比對；使用Prabi-Geland在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)預測氨基酸的二級結構；使用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)構建蛋白三維模型。

表1 中華鱉GnRH 1基因序列擴增引物信息

1.5 中華鱉GnRH 1系統發育分析

從GenBank下載墨西哥箱龜(Terrapenemexicanatriunguis,XP_024067919.1)、西部頸龜(Chrysemyspictabellii,XP_005285222.1)、綠海龜(Cheloniamydas，EMP30498.1)、美國短吻鱷(Alligatormississippiensis，KYO44455.1)、揚子鱷(A.sinensis，XP_014377775.1)、原雞(Gallusgallus，NP_001074346.1)、綠頭鴨(Anasplatyrhynchos，XP_012959602.1)、卡氏小鼠(Muscaroli，XP_021038275.1)、人(Homosapiens，NP_000816.4)、牛(Bostaurus，NP_001071605.1)、馬(Equuscaballus，XP_003364546.3)、非洲象(Loxodontaafricana，XP_023406765.1)、白鯨(Delphinapterusleucas，XP_022450743.1)、帝王鮭(Oncorhynchustshawytscha，XP_024296453.1)、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch，XP_020344148.1)、斑馬擬麗魚(Maylandiazebra，XP_004544170.1)、大黃魚(Larimichthyscrocea，KKF17334.1)、青鳉(Oryziaslatipes，NP001098169.1)、黃鱔(Monopterusalbus，XP_020446236.1)等20種物種的GnRH1氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件經Clustalw序列比對后，以鄰接法(Neighbor-Joining)1 000次bootstraps，構建基于GnRH1氨基酸序列的分子系統進化樹。

1.6 GnRH 1基因mRNA在中華鱉不同組織及不同發育時期的表達特征

以雌雄個體不同組織和不同發育時期胚胎的cDNA作為熒光定量PCR(qRT-PCR)模板，依據中華鱉GnRH1基因設計qRT-PCR引物，18s rRNA內參基因引物采用已發表序列[11](表1)。利用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測GnRH1 mRNA相對表達情況，每個樣品重復3次。PCR反應體系為20 μL：2×SYBR Premix ExTaq 10 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA 2 μL，超純水 6.8 μL；擴增程序為；95 ℃預變性 30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火34 s，共40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃退火 60 s，95 ℃ 15 s。結果采用2-ΔΔCt方法進行分析，數據分析利用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析，差異顯著性以P<0.05為標準，數據結果用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果

2.1 中華鱉GnRH 1基因的克隆及序列特征

克隆獲得的中華鱉GnRH1基因全長cDNA共為546 bp，5′ UTR區99 bp，3′ UTR區168 bp，編碼區279 bp，含有1個加尾信號序列AATAAA(491 bp處)及PolyA(30 bp)尾，共編碼92個氨基酸；具有N端信號肽(1～23 aa)、核心十肽區域(24～33 aa)和相關肽區域(37～92 aa)，以及斷裂位點GKR(34～36 aa)，符合GnRH蛋白典型結構特征(圖1)。

圖1 中華鱉GnRH 1 cDNA 序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 GnRH 1 cDNA sequence and putative amino acid of P.sinensis

2.2 中華鱉GnRH 1氨基酸序列

采用MEGA 7軟件構建基于中華鱉GnRH1和其他20個物種氨基酸序列的系統進化樹(圖2)。結果表明，中華鱉首先與龜鱉目的墨西哥箱龜、西部頸龜、綠海龜聚為一支，然后與爬行綱的美國短吻鱷、揚子鱷再聚為一支，最后與鳥綱中的原雞和綠頭鴨聚在一起，5種哺乳綱物種和6個硬骨魚綱物種均單獨聚為一支。

圖2 基于GnRH 1氨基酸序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree for different species based on GnRH 1 AA sequences“☆”表示中華鱉

2.3 中華鱉GnRH 1基因的生物信息學

中華鱉GnRH1 cDNA序列及其推導的氨基酸序列。起始密碼子和終止密碼子用灰色陰影部分標出，GnRH1信號肽用單下劃線表示，斷裂位點 GKR 用雙下劃線表示，GnRH1核心十肽置于方框內，GnRH1相關肽(GAP)用虛下劃線表示，*表示終止密碼子，波浪線代表3′非翻譯區加尾信號AATAAA(圖3)。

中華鱉GnRH1基因編碼的蛋白質理論分子質量為10.23 kDa，分子式為C454H725N121O135S6，理論等電點pI為5.65，不穩定指數為53.10，脂溶指數為86.96，總平均疏水指數為-0.172，為親水性蛋白。信號肽和跨膜區預測結果顯示，該蛋白信號肽切割位點位于第23和24個氨基酸殘基之間，N-端具有一個由23個氨基酸組成的信號肽以及一個跨膜區(7～29 aa)，為分泌蛋白；磷酸化位點有5個Ser，1個Thr，1個Tyr；無N糖基化位點。該蛋白二級結構中α-螺旋占68.48%，隨機卷曲占20.65%，β-轉角占6.52%。基于同源氨基酸構建的中華鱉GnRH1氨基酸三維模型(圖4)，顯示該蛋白為單鏈蛋白。

圖3 GnRH 1氨基酸序列比對Fig.3 Multiple sequences alignment of GnRH 1 amino acidsquences from different species黑色標注保守氨基酸，紅色標注相似性大于75%的氨基酸，藍色標注相似性大于50%的氨基酸

圖4 中華鱉GnRH 1蛋白三級結構模式圖Fig.4 Tertiary structure pattern of GnRH 1 protein in P.sinensis

2.4 中華鱉GnRH 1基因表達特征

通過qRT-PCR對中華鱉GnRH1基因在雌雄不同種組織中的表達特異性進行分析，結果表明(圖5)，GnRH1基因在所檢測的8組織中均有表達，但表達量存在較大差異。雌性和雄性個體中GnRH1基因均在腦中表達量最高，在心臟中表達量最低，幾乎不表達，在腸和脾臟組織中略有表達。在雌雄個體之間，在雄性腦和性腺中的表達量顯著高于雌性(P<0.05)。中華鱉GnRH1基因在第8期、第10期至第18期10個發育時期胚胎中的表達情況如圖6所示，GnRH1基因在第8期到第11期表達量很低，第12期開始表達量顯著增高，并維持到第14期，第15期又出現顯著增高，第16期表達量最高，然后呈下降趨勢。

圖5 中華鱉GnRH 1基因在成體組織的表達分析Fig.5 The expression of GnRH 1 in adult tissues of P.sinensis1：心臟；2：肝臟；3：腸；4：腦；5：肌肉； 6：性腺；7：肺；8：脾臟；*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

圖6 中華鱉GnRH 1基因在胚胎各時期的表達Fig.6 The expression of GnRH 1 in different stages of embryo不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論與結論

本研究克隆獲得的中華鱉GnRH1基因包括99 bp 5′端非編碼區，279 bp完整編碼區和168 bp 3′端非編碼區，共編碼92個氨基酸，核心十肽為QHWSYGLQPG。GnRH1基因編碼蛋白含有一個由23氨基酸構成的信號肽，為分泌蛋白和親水性蛋白，預測三維結構為單鏈蛋白，符合GnRH蛋白的典型特征，這與京海黃雞GnRH1蛋白性質的研究具有相似的結果[12]。不同物種間GnRH1氨基酸序列具有較高的保守性，中華鱉與綠海龜的相似性最高為91%，與同為爬行綱的墨西哥箱龜、西部頸龜、美國短吻鱷和揚子鱷同源性分別89%、88%、75%和75%。系統發育表明，所分析的物種分為爬行類、鳥類、哺乳類及魚類，與其分類地位一致，中華鱉與同為龜鱉目的綠海龜親緣關系最近。研究表明GnRH1的信號肽和核心十肽部分非常保守，但在不同物種間，GAPs同源性很低[14]。GnRH1是促進性激素分泌的激素的主要形式，在不同物種中的特異性比較高，對個體性腺發育和配子生成有重要作用[9,13]。

在牙鲆、圓斑星鰈、美洲鰣魚和許氏平鮋等眾多物種中GnRH1基因的表達特征呈現出表達的普遍性，但在一些不同的物種中也存在差異[14-17]。美洲鰣魚中GnRH1的表達呈現出性別二態性，雌性美洲鰣魚腦組織中GnRH1的表達水平顯著高于雄性，從生長上來看，雌性個體往往比雄性個體大，呈現出生長差異。Swapna等研究了GnRH1基因在羅非魚雌雄間性的差異性表達發現，雄性羅非魚GnRH分泌神經元比雌性提前出現10 d，數量上也高于雌性；雄性羅非魚的生長速度快于雌性，且體型往往比雌性大，分泌時間與分泌水平表現出的差異，可能與性別的分化以及生長的速度有關[18]。在魚類中，GnRH類似物可促進垂體中生長激素(Growth hormone，GH)的分泌與合成，提高魚類的生長速率，給鯉、草魚、羅非魚和黑鯛等注射GnRH類似物可以提高其血清中的GH水平從而提高其生長速率[19-21]。本研究中中華鱉GnRH1表達呈現性別差異性，且在雄性個體的腦和性腺組織中的表達高于雌性，從二者的生長情況上來看，雄性個體往往比雌性大，呈現出生長上的差異，這與在美洲鰣魚及羅非魚中的研究類似[16，18]。

基于Tokita等[10]對中華鱉胚胎發育的分期，30 ℃孵化的第15 天處于胚胎發育處于第14期和第15期之間。本研究中中華鱉GnRH1在胚胎發育第15期表達量急劇上升，與李慧君[22]認為在第15天原始性腺形成的觀點一致，表明該基因的表達與胚胎性腺發育有著密切關系。在美洲鰣魚、大菱鲆、條紋鱸[16,23-25]等的研究中也發現GnRH1的表達與性腺發育存在周期間一致性變化，推測該基因在中華鱉中與性腺發育同樣密切相關，后續將進行相關研究驗證。

本研究克隆獲得了中華鱉GnRH1基因序列，其編碼蛋白含有一個由23氨基酸構成的信號肽，為分泌蛋白和親水性蛋白；并獲得了GnRH1基因在中華鱉不同組織及不同發育時期胚胎中的表達特征，為深入了解中華鱉生長繁殖的調控機制提供理論基礎。但是由于僅研究了1齡雌雄中華鱉不同組織中的表達差異，后續還需要對中華鱉GnRH1基因在不同發育階段組織中的表達特征進行進一步的研究，以期獲得與雌雄生長差異之間的關系。