大鯢源致病性弗氏檸檬酸桿菌的分離、鑒定和藥物敏感性

蘇 英，吳榮華，申君宇，李偉平，何 滔，李 云，丁詩華

(西南大學動物科技學院，重慶生態漁業產業技術研究院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400715)

大鯢(Andriasdavidianus)俗名“娃娃魚”，隸屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，為國家二級水生野生保護動物，具有很高的營養、藥用及觀賞價值[1]。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，普遍存在于土壤、酸性溫泉、放射性廢物、水和地殼深處，可在植物和動物的活體中生長[2]，可感染人和動物，引起腹瀉、食物中毒和繼發感染[3]，是一種典型的人-獸-魚共患病條件性致病菌[4]。弗氏檸檬酸桿菌對水生動物的致病性報道較多。1982年，Sato等[5]從皮膚腐爛、出血的翻車鲀(Molamola)體內分離到弗氏檸檬酸桿菌。隨后，又有關于弗氏檸檬桿菌引起鱘(Acipenserschrenckii)、花鰻鱺(Anguillamarmorata)等發病死亡的報道[6-7]。2001年，李華等[8]首次報道了弗氏檸檬酸桿菌可引起河蟹(EriocheirsinensisH.)敗血癥，也可引起紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)、中華鱉(Trionyxsinensis)、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等患病[9-11]。由于該菌對抗生素的敏感性因宿主來源而異[6-11]，因此有必要對其進行藥物敏感性分析，以期為疾病治療提供科學參考依據。

本研究從患病大鯢內臟器官分離得到一株優勢病原菌，對分離菌株采用形態學觀察、生理生化特性測定和16S rRNA、aspC管家基因測定進行鑒定，確定其為弗氏檸檬酸桿菌。人工感染發現分離菌株對健康大鯢具有很強的致病性，胞外酶分析發現其致病性可能跟其產生卵磷脂酶相關。同時，對分離菌株開展了藥物敏感性試驗，以期為大鯢細菌性疾病的防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物材料

重慶梁平某大鯢養殖場，2017年5月開始陸續有大鯢死亡，死亡的大鯢為2齡成體魚，體重在500 g左右，損失較大。發病水溫一般在21 ℃，溫度越高，發病率越高，溫度低于21℃也發病，但發病率較低。病鯢外部癥狀主要表現為腹部腫大、食欲不振、四肢充血潰爛和口腔發炎充血，剖檢可見胃、腸道充血。144尾(500±40)g健康大鯢與發病大鯢是同一個品系，購買自武隆某大鯢養殖場，避光暫養于水溫25 ℃的流水養殖系統，暫養一周后無異常癥狀，用于后續感染實驗。

1.1.2 試劑

細菌微量生化反應管和藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。細菌基因組DNA 提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。2×Taq MasterMix購于索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

在超凈工作臺中，用酒精棉擦拭病鯢體表，無菌解剖，接種環蘸取胃、腸、肝、腎、脾組織，劃線接種于普通營養瓊脂(NA)培養基，28 ℃培養24 h后，挑取形態特征一致的菌落進行劃線純化，獲得純培養。分離菌株接種于腦心浸液培養基(BHI)28 ℃培養24 h，與40%無菌甘油等體積均勻混合，置于-80 ℃ 保存備用。

1.2.2 細菌鑒定

1.2.2.1 形態學觀察

將菌株int1705接種于NA培養基上，28 ℃培養24 h后，記錄其菌落形態特征，并進行革蘭氏染色觀察。

1.2.2.2 生理生化特性測定

將-80 ℃ 保存的純化菌株接種于BHI液體培養基，28 ℃，180 r/min振蕩培養18 h，接種細菌微量生化反應管，28 ℃培養24～48 h，參照《伯杰細菌鑒定手冊》進行細菌鑒定。胞外酶活性(溶血活性、酯酶、脲酶、淀粉酶、卵磷脂酶、明膠酶)檢測根據陳言峰等[12]和Rozhavin等[13]的方法進行。

1.2.2.3 16S rRNA和aspC基因的序列分析

根據DNA提取試劑盒說明書提取菌株基因組DNA，以分離菌株基因組DNA做為模板，用細菌16S rRNA 通用引物(正向引物5′→3′：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物5′→3′：GGTTACCTTGTTACGACTT)、aspC管家基因引物(正向引物5′→3′：GTTTCGTGCCGATGAACGTC；反向引物5′→3′：AAACCCTGGTAAGCGAAGTC)分別進行PCR 擴增。反應體系為50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL，DNA 模板(100 ng/μL)4 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各2 μL，加入ddH2O 至總容量為50 μL。PCR 反應條件：94 ℃變性3 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃/56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR結束后，產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，凝膠成像儀中進行產物分析并拍照，然后回收產物，送至北京六合華大基因進行測序分析。

將分離菌株的16S rRNA 及aspC管家基因序列通過美國國立生物技術信息中心(NCBI )中BLAST檢索系統進行序列同源性分析，并進行比對。使用軟件MEGA5.1中鄰接法(NJ,Neighbour-joining)構建系統發育樹，步展值(Bootstrap value)設為1 000進行置信度檢測。

1.2.3 人工感染試驗

將分離菌株int1705接種于BHI液體培養基中，28 ℃，180 r/min振蕩培養18 h，4 000g離心10 min，用無菌PBS緩沖液洗滌沉淀3次，麥氏比濁法測定細菌濃度。調整菌液濃度為五個梯度。暫養后的健康大鯢隨機平均地分為5個實驗組和1個對照組，每組各8尾。5個實驗組分別腹腔注射1 mL濃度為1×109、1×108、1×107、1×106和1×105CFU/mL的菌液，對照組注射同體積的0.01 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，實驗組和對照組都設置三個平行。實驗期間保持水溫25 ℃，溶氧充足。每天觀察大鯢活動情況，記錄各組實驗動物死亡情況，對瀕死大鯢進行解剖觀察，從肝臟、脾臟、腎臟、腸道、胃分離純化致病菌菌株。對實驗動物的半致死濃度(LD50)采用累計法(Reed-Muench)計算。

1.2.4 藥敏試驗

采用紙片擴散法(KB,kirby-baner法)對分離菌株進行藥敏試驗。通過麥氏比濁法，調整菌液濃度為0.5麥氏標準(1.5×108cfu/mL)，無菌條件下使用無菌棉棒均勻涂布于MH瓊脂培養基平板。用無菌鑷子取待測藥敏紙片，貼于MH培養基表面，37 ℃培養16～18 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑。根據杭州微生物試劑有限公司說明書標準，判斷藥物的敏感程度。

2 結果

2.1 病原菌分離純化

從大鯢胃、腸、肝臟、腎臟、脾臟取樣于NA培養基上劃線，經28 ℃恒溫培養24 h，從胃、腸、脾臟均獲得一株優勢細菌，編號int1705。分離菌株在普通營養瓊脂平板上生長良好。

2.2 人工感染試驗

int1705菌株對每尾大鯢LD50為3.16×106CFU/mL。注射組大鯢出現不同程度的死亡情況，注射PBS的對照組未出現死亡(如圖1所示)。發病大鯢主要癥狀為口腔發炎潰爛、后肢充血潰爛、腸胃出血和膽囊腫大等癥狀(圖2)。從發病大鯢的腸道、胃部、脾臟充血處分離得到優勢菌株，表明菌株int1705是大鯢此疾病的病原菌。

圖1 大鯢注射不同濃度int1705菌株的累積死亡率Fig.1 Cumulative mortality of A.davidianus challenged with different doses of int1705 via intraperitoneal injection

圖2 大鯢發病癥狀Fig.2 The symptoms of hemorrhagic tissues A:口腔潰爛出血；B: 充血潰爛的后肢；C:胃腸充血

2.3 細菌鑒定

2.3.1 形態特征

菌株int1705在NA培養基上培養，菌落形態呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，中央稍微凸起，為乳白色，菌落直徑2～4 mm。革蘭氏染色為陰性，鏡檢觀察其為兩端鈍圓，長2～6 μm，直徑1 μm的短桿菌(圖3)。

圖3 int1705菌株的革蘭染色Fig.3 Gram staining of the int1705 strain

2.3.2 生理生化特性

菌株int1705生理生化特性見表1。參照《伯杰氏系統細菌學手冊》，菌株int1705的生理生化特性符合弗氏檸檬酸桿菌特征。

對菌株int1705溶血酶、脂酶、脲酶、淀粉酶、明膠酶的檢測，結果均為陰性，卵磷脂酶的檢測結果為陽性。

表1 int1705菌株的生理生化特性

2.3.3 16S rRNA基因和aspC管家基因序列分析

菌株int1705的16S rRNA、aspC基因經PCR 擴增后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4(泳道3和泳道4)所示，序列長度分別為1 442 bp和502 bp，與預期產物大小一致，陰性對照(泳道1和2)無條帶出現。

圖4 分離株int1705的16S rRNA及aspC基因序列的PCR擴增產物電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of 16S rRNA and aspC gene fragments from int1705泳道M：DNA 分子質量標準(DL2000)；泳道1-2：aspC和16S rRNA基因序列PCR陰性對照。泳道3-4：aspC和16S rRNA基因PCR擴增產物。

將獲得的序列在NCBI的BLAST系統中進行序列同源性分析，結果表明分離株int1705的16S rRNA 基因與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，登錄號為KC210829.1)的同源性達99%，系統進化樹結果(見圖5)顯示，分離株int1705與弗氏檸檬酸桿菌處于同一分支。aspC 管家基因序列分析結果顯示與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，登錄號為HQ111096.1)的同源性達99%，系統進化樹結果(見圖6)亦顯示與弗氏檸檬酸桿菌處于同一分支。

圖5 int1705菌株16S rRNA 基因序列與部分相關菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of int1705 and related strains

圖6 int1705菌株aspC 序列與相關菌株的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on aspC sequences of int1705 and related strains

2.4 藥物敏感性

菌株int1705對多粘菌素B、丁胺卡那、羧芐西林、哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、諾氟沙星、氧氟沙星、復方新諾明等10種藥物敏感，對慶大霉素、卡那霉素、四環素、米諾環素和多西環素等5種藥物中度敏感，對苯唑西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、克林霉素、麥迪霉素、新霉素、青霉素等7種抗菌藥物存在不同程度的耐藥性，詳細藥敏試驗結果見表2。

表2 分離株的藥物敏感性

注：S：敏感；I：中度敏感；R：耐藥。

3 討論

過去認為弗氏檸檬酸桿菌是腸道致病菌，但近年來發現，臨床上毒力較強的菌株可能穿過腸道黏膜，進而在全身擴散傳播，引起機體系統感染，而不僅僅局限于腸道感染[4]。張冬星等[14]的研究中，發現弗氏檸檬酸桿菌可引起團頭魴(Megalobramaamblycephala)肛門紅腫，腹腔積液，魚鰾和肝嚴重出血，腎、脾腫大等病理性變化。盧君輝等[15]從烏翅真鯊(Carcharhinusmelanopterus)病魚肝臟、腹腔及腸道中分離得到弗氏檸檬酸桿菌。其他研究表明弗氏檸檬酸桿菌可導致錦鯉(CyprinuscarpioL.)、鯽(Carassiusauratus)發病[16-17]，病魚主要表現豎鱗、皮膚腐爛、腹腔積液和肛門紅腫等癥狀。本試驗從患病大鯢體內分離的int1705，經過16S rRNA和aspC保守序列測序及系統發育學分析，發現該菌株與弗氏檸檬酸桿菌的同源性高達99%，結合形態特征、生理生化特性將該菌株鑒定為弗氏檸檬酸桿菌。菌株經回歸感染試驗發現可使健康大鯢患病，感染器官組織與其他宿主較為一致，都有皮膚腐爛，腹腔積液，組織充血的病理性特征。從回歸感染的患病大鯢分離的病原菌的生理生化特性和16S rRNA保守序列與分離株int1705一致，因此確認該菌株為導致大鯢出現腹腔腫脹、皮膚潰爛癥狀的病原菌?；貧w感染試驗測得該菌對大鯢的半致死濃度(LD50)為3.16×106CFU/mL。通過選擇培養基檢測弗氏檸檬酸桿菌可能產生的外毒素，結果顯示，菌株int1705不產生溶血素、酯酶、脲酶、淀粉酶、溶膠酶，產生卵磷脂酶，能造成細胞膜損傷，導致其出現充血潰爛等癥狀[18]。其致病機制尚有待進一步研究。

弗氏檸檬酸桿菌對抗生素的敏感性因宿主來源和環境而異。從印度病人腸道分離和引起東北虎出血性腹瀉的弗氏檸檬酸桿菌具有不同的耐藥性[19,20]。而在水生動物中，不同魚類來源的弗氏檸檬酸桿菌的耐藥情況也有所不同。大鯢源的int1705與施氏鱘[6]、河蟹[8]、紅螯螯蝦[9]來源的致病性弗氏檸檬酸桿菌藥敏結果存在差異：int1705對新霉素耐藥，對多粘菌素B敏感，而來源于施氏鱘的弗氏檸檬酸桿菌對新霉素敏感，對多粘菌素B耐藥；來源于河蟹的菌株對四環素耐藥，來源于紅螯螯蝦的菌株對四環素敏感，而int1705對四環素中度敏感。因此在養殖過程中如發生細菌性病害應及時進行病原分離和藥敏試驗，以篩選出敏感藥物有針對性地進行治療。