亞硝酸鹽脅迫對草魚肝臟泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響

孫怡晴，梁 驍，熊 梅，ONXAYVIENG Kommaly ，2，湯 蓉，李大鵬

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，武漢 430070；2.家畜和漁業(yè)部，農(nóng)林部，老撾萬象 6644)

亞硝酸鹽是生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的污染物。在池塘精養(yǎng)過程中，由于投餌量大以及殘餌糞便大量沉積會產(chǎn)生大量的氨，缺氧時硝化作用受阻，會引起亞硝酸鹽在水環(huán)境中積累。養(yǎng)殖水體中較高濃度的亞硝酸鹽通常會對魚類引起毒理效應(yīng)，導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)，危害養(yǎng)殖魚類存活和健康。環(huán)境應(yīng)激通常會直接或間接地引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的改變，影響動物的生長和發(fā)育。

在脊椎動物中，有三個主要的系統(tǒng)對蛋白質(zhì)降解起關(guān)鍵作用，即泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，溶酶體自噬系統(tǒng)和鈣蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是一個調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)[1]。UPS降解細胞內(nèi)聚集的或錯誤折疊的蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡、代謝、免疫應(yīng)答、信號傳遞、轉(zhuǎn)錄控制、應(yīng)激應(yīng)答等生物學過程[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體等組成。泛素化是一個ATP依賴型的耗能過程，主要包括兩個步驟:首先，通過E1、E2、E3使目標蛋白與泛素形成一條多聚泛素鏈；其次，多聚泛素鏈被26S蛋白酶體識別并降解為小肽或氨基酸[3]。E3連接酶可以對不同的底物進行特異性的識別，表現(xiàn)了蛋白降解的高度選擇性。

UPS的核心組分可以作為應(yīng)激傳感器直接參與應(yīng)激感知，如E3連接酶CRL3KEAP1、SCFMET30和SCFFBXL5。Nrf2是由E3連接酶調(diào)控的典型轉(zhuǎn)錄因子，同時是氧化應(yīng)激的重要傳感器[4]。各種應(yīng)激條件如熱、滲透、氧化和重金屬引起的應(yīng)激反應(yīng)可能會導(dǎo)致蛋白損傷，從而引起蛋白質(zhì)的錯誤折疊。作為第一反應(yīng)，不同的伴侶系統(tǒng)(如HSP70、HSP90)嘗試重新折疊蛋白；當重折疊不成功時，這些蛋白通過CHIP(E3)的作用被UPS降解[5]。研究表明，生活在0 ℃以下的南極魚類鰓和肝臟中20S蛋白酶體活性隨著溫度升高而增強[6]。在酵母中的研究結(jié)果表明蛋白酶體與Hul5(HECT型泛素連接酶)在清除細胞質(zhì)內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)時發(fā)揮積極作用[7]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國主要的大宗淡水養(yǎng)殖種類，也是世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的水產(chǎn)品種。急性亞硝態(tài)氮濃度的升高會使草魚免疫性能下降、氧化應(yīng)激反應(yīng)加強[8]、甲狀腺激素代謝平衡被擾亂及甲狀腺功能減退[9]。雖然泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在魚類蛋白質(zhì)代謝中具有重要的作用，但亞硝酸鹽脅迫對魚類該系統(tǒng)的影響目前了解甚少。本研究以草魚幼魚為實驗對象，進行亞硝酸鹽的急性脅迫實驗，探究亞硝酸鹽脅迫對草魚肝臟泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響，旨在為養(yǎng)殖環(huán)境控制和提升養(yǎng)殖魚類品質(zhì)提供基礎(chǔ)科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與實驗設(shè)計

實驗用草魚(94.88±16.54 g)購自湖北省黃岡市團風縣百容良種場，實驗前暫養(yǎng)1周，養(yǎng)殖用水為曝氣的自來水。實驗采用亞硝酸鈉溶液作為亞硝酸鹽脅迫溶液，設(shè)置對照組和實驗組，對照組亞硝酸鈉濃度為0 mg/L，實驗組暴露濃度為0.5 mg/L和20 mg/L。在暴露12、24 、48和96 h后，分別從每組采集8尾魚麻醉(MS-222，250 mg/L)后采集組織樣品，用于生物化學、組織學、分子生物學的檢測。實驗期間，水溫24.0～26.0 ℃，pH值為7.5±0.3，24 h連續(xù)曝氣，溶氧保持在7 mg/L以上，每12 h更換試液一次以保證實驗暴露濃度的穩(wěn)定性。

1.2 實驗方法

1.2.1 血液生化指標測定

葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)在全自動生化分析儀(Selectra XL，荷蘭威圖科學公司)上測定，試劑盒購自武漢康瑞嘉科技有限公司。皮質(zhì)醇的測定采用放射性免疫法(RIA)，試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2.2 相關(guān)基因表達水平檢測

總RNA提取及cDNA合成：取約80 mg樣品使用Trizol(Vazyme)提取總RNA，在1.1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測樣品RNA完整性，并通過分光光度計法測定濃度。使用帶有g(shù)DNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara)的PrimeScript RT試劑盒，根據(jù)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。

基因的引物設(shè)計：根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)。選用β-actin為實時熒光定量PCR內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選取psma2(20S proteasome subunit alpha type 2)和psmc1(26S proteasome subunit ATPase 1)分別代表26S 蛋白酶體的20 S亞基和19 S亞基。

實時熒光定量PCR：反應(yīng)體系包括10 μL HieffTMqPCR SYBRGreen Master Mix(No Rox Plus)(YEASEN)，各0.4 μL上、下游引物，7.2 μL雙蒸水，2 μL cDNA模板，在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Detection System(Applied Biosystems，USA)進行熒光定量反應(yīng)。反應(yīng)程序：首先95 ℃預(yù)變性5 min，再進行95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。

表1 實驗所用引物序列

1.2.3 泛素化蛋白含量測定

使用Dot-Blot 方法測定肝臟組織泛素化蛋白含量。用RIPA 裂解緩沖液(廣州捷倍斯生物科技有限公司)提取肝臟中的總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒(廣州捷倍斯生物科技有限公司)測定濃度，PBS調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度，使?jié)舛缺３忠恢?0.67 μg/μL)。移取100 μL樣品至Bio-Dot(Bio-Rad)，通過抽濾裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Millipore)。將NC膜置于封閉液中孵育1 h以阻斷非特異性結(jié)合，然后多聚泛素化蛋白抗體(FK1)(Biomol，BML-PW8805-0500)4 ℃孵育過夜。FITC標記的二抗(BOSTER，BA1101)孵育2 h后，通過Odyssey CLx(LI-COR，CLx-0813)顯影分析，使用Image J讀取各斑點灰度值。

1.2.4 肝臟組織學觀察

實驗96 h后，采集20 mg/L暴露組草魚肝臟樣品保存于多聚甲醛中，制作石蠟組織切片，用蘇木素-伊紅染色。在Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察組織學結(jié)構(gòu)，并進行拍照分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當P<0.05時，差異顯著。使用Graphpad PrismV5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 血液生化指標

由圖1-A可知，在實驗12、24和48 h時，亞硝酸鹽脅迫顯著提高了草魚血清皮質(zhì)醇含量；在96 h時恢復(fù)至對照水平。在0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫下，血清葡萄糖的含量在24、48和96 h時均出現(xiàn)顯著性下降(圖1-B)。血清中膽固醇的含量在亞硝酸鹽脅迫期間，無顯著性變化(圖1-C)。在0.5 mg/L暴露組，甘油三酯和總蛋白的含量在24 h顯著降低(圖1-D、E)。在0.5 mg/L暴露組，血清中白蛋白含量在24 h顯著低于對照組，在48 h和96 h顯著高于對照組(圖1-F)。

圖版1 亞硝酸鹽暴露對草魚幼魚血清生化指標的影響Plt.1 Serum biochemical parameters of C.idellus juveniles exposed to different nitrite concentration*表示同一暴露時間內(nèi)與0 mg/L組比較有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果以均值±標準誤的形式表示(n=8)，圖版2、圖版3同。

20 mg/L亞硝酸鹽脅迫24 h后ALP的含量顯著性升高(圖1-G)。在0.5 mg/L暴露組中，血清中ALT含量與暴露時間負相關(guān)，在12 h與24 h顯著性升高，在48 h與96 h顯著性降低。在20 mg/L暴露組中，其含量在48 h和96 h顯著性低于對照組(圖1-H)。20 mg/L亞硝酸鹽脅迫24 h時，血清AST的含量顯著升高；但在12 h及96 h時，其含量顯著降低。0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫12 h時，AST含量顯著高于對照水平；在48 h和96 h時，其含量與對照組相比顯著降低(圖1-I)。

2.2 Nrf2 和hsp70的表達

20 mg/L亞硝酸鹽脅迫下，nrf2的表達量在12 h與48 h出現(xiàn)顯著性升高；在0.5 mg/L暴露組，其表達量在24 h顯著降低，在48 h顯著升高(圖2-A)。在20 mg/L暴露組，hsp70的表達量在12、24和48 h均顯著性升高，在96 h恢復(fù)至對照水平；在0.5 mg/L暴露組，hsp70的表達量在12、48和96 h顯著升高，在24 h其表達量顯著低于對照組(圖2-B)。

圖版2 亞硝酸鹽暴露對草魚幼魚肝臟nrf2,hsp70相對表達量的影響Plt.2 Relative expression of nrf2 and hsp70 in the liver of C.idellus exposed to nitrite基因的表達量以0 mg/L組為1。

2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性

圖版3 草魚幼魚肝臟UPS相關(guān)基因的相對表達量和泛素化蛋白的相對含量Plt.3 Relative expression of genes and ubiquitinated proteins in the liver of grass carp 泛素化蛋白的表達量以0 mg/L組為1。

在20 mg/L暴露組，chip的mRNA水平在12、24和48 h顯著升高，在96 h與對照組相比無顯著不同(圖3-A)。Ub的表達量在亞硝酸鹽脅迫的不同時間點均存在劑量依賴式上升(圖3-B)；0.5 mg/L暴露組，其表達量在24 h和48 h顯著降低，在12 h和96 h顯著性升高；在20 mg/L暴露組中ub的表達水平均顯著高于對照組。在20 mg/L暴露組，psma2的mRNA水平在24 h顯著升高，在48 h顯著下降；0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫使psma2表達量在12 h顯著升高，24 h和48 h顯著降低(圖3-C)。psmc1的mRNA水平在0.5 mg/L脅迫48 h顯著降低；在20 mg/L脅迫24 h其表達水平顯著升高，在48 h顯著降低(圖3-D)。在0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫12、48和96 h，肝臟泛素化蛋白的含量顯著性升高。在20 mg/L暴露組中，泛素蛋白含量在12、24和96 h顯著高于對照組(圖3-E)。

2.4 肝臟組織病理學觀察

由圖4-A可觀察到，對照組的肝細胞形狀正常，總體形態(tài)規(guī)律，細胞核位置明顯；而草魚肝細胞在20 mg/L的亞硝酸鹽脅迫96 h后，肝細胞出現(xiàn)明顯脂肪空泡化現(xiàn)象(圖4-B)。

圖4 20 mg/L亞硝酸鹽暴露96 h對草魚幼魚肝臟的組織學影響Fig.4 The hepatic histological change in grass carp exposed to 20 mg/L of nitrite for 96 h.A：對照組；B：暴露組；HE×200。

3 討論

3.1 血清生化指標

魚類的血液承擔機體營養(yǎng)代謝和信息傳遞的重要作用，在生理學研究中，可以通過魚類血液生化指標的變化來衡量其應(yīng)激水平、營養(yǎng)狀況、代謝狀態(tài)等。皮質(zhì)醇的含量變化作為檢測應(yīng)激反應(yīng)重要的指標之一，在魚體受到外界環(huán)境刺激后，通過下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI)分泌，可幫助機體對抗環(huán)境應(yīng)激[10]。草魚在高濃度的亞硝酸鹽脅迫短時間內(nèi)血清皮質(zhì)醇含量上升，表明草魚產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，實驗后期已恢復(fù)至對照水平，在鳙(Aristichthysnobilis)的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[11]，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)在急性的亞硝酸鹽暴露下血清皮質(zhì)醇水平也顯著升高[12]。有研究指出，亞硝酸鹽脅迫可以通過激活HPI軸使皮質(zhì)醇分泌增多，從而提高葡萄糖水平[13]。本實驗中，0.5 mg/L亞硝酸鹽暴露組的葡糖糖含量在24、48、96 h均呈現(xiàn)顯著下降，這可能是由于魚體內(nèi)能量物質(zhì)的大量消耗。在暗紋石斑魚(Sebastesinermis)的研究中也發(fā)現(xiàn)血清中葡萄糖的含量隨著亞硝酸鹽暴露時間的延長而明顯下降[14]。

甘油三酯和膽固醇作為魚類脂質(zhì)代謝中的重要物質(zhì)，在抵抗外界環(huán)境應(yīng)激的時候發(fā)揮重要作用，堿性磷酸酶是一種代謝調(diào)節(jié)酶，可以促進魚體營養(yǎng)的吸收和利用[11]，亞硝酸鹽暴露濃度及時間對草魚血清中甘油三酯，膽固醇和堿性磷酸酶影響不大。在本研究中0.5 mg/L的亞硝酸鹽脅迫提高了血清中白蛋白的含量，白蛋白作為血清中主要的蛋白質(zhì)成分能夠維持滲透壓平衡[15]。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝臟、心肌組織中的重要轉(zhuǎn)氨酶，在正常生理狀態(tài)下，這些酶在血清中活性穩(wěn)定，當肝細胞受應(yīng)激等引起病變或損傷時，組織細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)的這兩種酶釋放到血液中。鳙在48.634 mg/L亞硝酸鹽氮暴露下其血清中這兩種酶的含量在48 h顯著升高，在恢復(fù)12 h 后達到對照水平[11]。強俊等[15]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)12 h 后，其血清中這兩種酶的含量顯著上升并在脅迫24 h 后降低。本實驗中草魚血清谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量先升高后下降，可能是因為短期內(nèi)亞硝酸鹽脅迫會使肝臟損傷加重，而脅迫后期，魚體基本適應(yīng)脅迫環(huán)境。

3.2 肝臟hsp70 和nrf2的相對表達

通常，除了血液中皮質(zhì)醇及葡萄糖的含量，HSP70和Keap1-nrf2通路的表達水平也可以反映魚類的應(yīng)激狀態(tài)[16]。在魚類中，熱休克蛋白(HSPS)的調(diào)控受機體本身的遺傳特性與外界環(huán)境的共同影響，HSP70可以作為分子伴侶參與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，以及對錯誤折疊蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)、降解[15,17]。在本實驗中，hsp70在肝臟中的表達量受高濃度亞硝酸鹽脅迫影響巨大。草魚受到亞硝酸鹽的脅迫后，hsp70 mRNA被誘導(dǎo)高表達以保護魚體減小損傷，環(huán)境應(yīng)激引起機體hsp70 mRNA表達上升可以在許多研究中發(fā)現(xiàn)。例如，大菱鲆在亞硝酸鹽脅迫96 h后血液中的hsp70的表達量出現(xiàn)顯著上調(diào)[12]，團頭魴(Megalobramaamblycephala)在34 ℃的熱應(yīng)激條件下其肝臟hsp70基因的表達量在6 h達最高，隨后開始下降[18]。除了熱休克蛋白，氧化應(yīng)激反應(yīng)同樣受到抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)節(jié)，通過Nrf2/ARE通路，激活靶基因，積極發(fā)揮抗氧化作用[19]。Nrf2的表達趨勢與hsp70相似，在高濃度亞硝酸鹽脅迫短期內(nèi)大幅度上調(diào)，96 h后恢復(fù)至對照水平，與鎘脅迫斑馬魚(Daniorerio)實驗的結(jié)果相似，這可能與抗氧化基因的增強密切相關(guān)[20]。葉元土等[21]發(fā)現(xiàn)，灌喂氧化魚油顯著改變了草魚“Keap1-Nrf2-ARE”調(diào)控的下游靶向通路，谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、熱休克蛋白和蛋白質(zhì)泛素化通路的基因均顯著性上調(diào)，用于清除氧化損傷的物質(zhì)和修復(fù)氧化損傷的細胞等。

3.3 UPS活性的檢測

在應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的錯誤折疊蛋白與未折疊蛋白首先被HSP70等熱休克蛋白重新折疊，當HSP70不能對其進行重新折疊時，CHIP作為HSP70的分子伴侶及重要的E3連接酶，可以識別HSP70-底物復(fù)合物，誘導(dǎo)該底物蛋白多聚泛素化并被UPS降解[5，17]。草魚肝組織中chip的表達趨勢與hsp70和nrf2的基本一致。我們發(fā)現(xiàn)肝臟中ub的表達量與亞硝酸鹽的脅迫濃度有顯著的正相關(guān)；psmc1和psma2的表達水平在20 mg/L亞硝酸鹽脅迫下在24 h顯著升高，因此UPS的活性在亞硝酸鹽脅迫短時間內(nèi)出現(xiàn)顯著的增強。有文獻指出溫度升高10 ℃顯著提高了南極魚類的肝臟及鰓組織中20S蛋白酶體活性[6]；藍綠光鰓魚(Chromisviridis)在高溫暴露12 h后，其血糖水平、鰓熱休克蛋白及泛素化蛋白的含量出現(xiàn)顯著上升[22]。本實驗中亞硝酸鹽脅迫提高了草魚肝臟中的泛素化蛋白含量。當草魚腸道黏膜受到嚴重的氧化損傷后，它產(chǎn)生許多損傷細胞及損傷蛋白質(zhì)，從而激活黏膜細胞中泛素蛋白酶體系統(tǒng)和熱休克蛋白顯著上調(diào)，以清除損傷或錯誤蛋白[21]。

3.4 組織病理學變化

魚類肝臟在調(diào)控基礎(chǔ)代謝、降解與排泄外源有毒物質(zhì)中發(fā)揮重要作用，并且可以作為魚體健康狀況的指示性參數(shù)，肝臟對于外界環(huán)境污染物特別敏感，這種敏感表現(xiàn)在肝臟組織所產(chǎn)生的實質(zhì)性的變化[23]。本實驗中，肝臟在高濃度亞硝酸鹽脅迫96 h后出現(xiàn)明顯的空泡化，鯰(Clariasgariepinus)和團頭魴(Megalobramaamblycephala)在亞硝酸鹽脅迫下其肝臟也表現(xiàn)相似的損傷[24-25]。Saraste等[26]認為，肝臟中細胞凋亡引發(fā)的一些形態(tài)學特征變化可能導(dǎo)致細胞形態(tài)的不規(guī)則，脂滴和空泡的形成。肝臟的抗氧化狀態(tài)與肝組織學存在一致性變化，在肝臟的解毒過程中可能產(chǎn)生ROS并導(dǎo)致對機體的氧化損傷。Zhang 等[27]發(fā)現(xiàn)當抗氧化系統(tǒng)不能及時消除肝臟中過量的ROS時，為避免羰基蛋白(CP)的積累造成氧化損傷風險加劇，組織中酶催化活性被降低，最終引起蛋白酶作用加強，加快降解蛋白質(zhì)。

綜上所述，急性亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致草魚產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，肝臟hsp70、nrf2的表達量顯著上升，造成了肝臟細胞損傷；泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性加強，通過清除損傷或錯誤蛋白來降低氧化損傷風險。