辛硫磷對鯽肝微粒體CYP3A酶活性、mRNA及蛋白表達的影響

李 思，劉曉宇，2

(1.華中農業大學食品科技學院，武漢 430070；2.環境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070)

有機磷化合物是殺滅傳染病媒介昆蟲、防治農作物病蟲害的有效藥物?，F使用的有200余種，常用的有辛硫磷、毒死蜱、敵敵畏、氧化樂果和敵百蟲等。其中我國生產的有機磷農藥占我國農藥總產量的50%以上[1]。目前，環境中的有機磷農藥對其造成的危害已嚴重制約了我國水產養殖業的發展和水產品的出口。辛硫磷作為一種常見的有機磷農藥廣泛應用于水產養殖中的清塘和病蟲害防治[2]，施用于田間的辛硫磷還可以通過地表徑流進入地表水，造成水體污染[3]。鯽(Carassiusauratusgibebio)是我國重要的大宗淡水魚類之一，位居大宗淡水魚第四位?，F今，國內外研究辛硫磷對水生生物，尤其是對在我國廣泛養殖的鯽的影響的研究十分不足。

細胞色素P450是1958年被發現的，它是一類以還原態與CO結合后在波長450 nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質。目前，已知的CYP450酶系主要由血紅素蛋白(P450、b5)、黃素蛋白(NADPH-P450還原酶、NADPH-b5還原酶)和磷脂(主要是磷脂酰膽堿)三種成分組成，共同構成一個電子傳遞體系[4]。細胞色素P450在同一動物的許多不同組織中都存在。對于脊椎動物，CYP450酶含量最豐富的器官一般為肝臟，在腎、皮膚、小腸、肺、腦、消化道、骨髓等組織器官也有分布[5]。CYP3A是CYP450家族中主要的一個亞族，在肝臟CYP450的含量為30%～40%，占據第一位，目前已發現越來越多的藥物由CYP3A催化代謝，且CYP3A還與許多前致癌物和前毒物的代謝活化有關[6]。CYP3A在魚類研究中應用廣泛，其作為一種生物標志物，應用于環境生態學和毒理學。目前，已有毒性物質，例如咪唑類離子液體[7]、多溴聯苯醚[8]、銅鎘重金屬[9]等對魚類CYP3A活性以及基因表達方面的研究，但是有關廣泛使用的農藥辛硫磷對其活性以及更深層次的轉錄水平和蛋白水平的研究還存在很大的不足。本研究旨在從酶活性、轉錄及翻譯水平研究辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A的影響以及其效應相互關聯性做初步的探索，為后期更深入探究有機磷農藥對水生生物的代謝調控機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所用鯽購自武漢鯽養殖場。平均重量為(107±14.2)g。實驗前，將鯽養殖于(50 cm×30 cm×20 cm)的玻璃水箱內，養殖用水為充分曝氣除氯后的自來水，馴養一周至穩定。增氧機連續增氧，每日換水一次并清理缸內雜物，溫度控制在(24±2)℃。

1.2 試劑及儀器

99%的辛硫磷分析標準品和紅霉素(E105345)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 還原型輔酶NADPH-Na4(>98%)購自北京索萊寶科技有限公司；動物組織/細胞總RNA提取試劑盒、第一鏈反轉錄試劑盒和2×SYBR qPCR Mix(熒光定量)均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔多抗CYP3A4(18227-1-AP)購于武漢三鷹生物技術有限公司；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001)購于杭州賢至生物有限公司；HRP標記羊抗兔二抗(BA1054)購于武漢博士德生物工程有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 引物合成

參照文獻[10]由武漢百捷智生物科技有限公司合成鯽CYP3A引物：F1(5′-CGA CCT TCG CCC TCC ACA G-3′)和 R1(5′-ACC TCA TCC CGA TGC AGT TCC-3′)以及β-actin內參基因引物：F2(5′-TCT TTT CCAGCC ATCCTT CCT A-3′)和R2(5′-GGT CAG CAA TGC CAG GGT A -3′)。

1.4 實驗設計

根據文獻[11]，選取0.082 5、0.165、0.330 mg/L(1/40、1/20、1/10的96 h LC50)分別作為實驗組的低、中、高濃度值。對照組為丙酮助溶劑組。因辛硫磷見光易分解，整個實驗過程避光進行，持續充氧，不喂食，采用半靜態染毒法。分別在染毒24、48、72和96 h后，迅速取出鯽肝臟，一部分用于提取RNA，一部分用于提取肝微粒體，提取后立即放入-80 ℃貯存。

1.5 肝微粒體的制備

采用差速離心法制備鯽肝微粒體，方法參照文獻[12]，稍作改動。迅速敲擊鯽頭部，昏迷后測體長、魚重，解剖，立即取出肝臟，用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS緩沖溶液反復漂洗去除紅細胞，濾紙上除去多余液體后稱重，轉入手持式勻漿器，按1∶4(W/V)的比例加入勻漿緩沖液，置冰浴中制成勻漿。將勻漿液轉入預冷離心管中，4 ℃條件下，12 000g離心20 min，棄去上層漂浮乳白色脂質，取出其余上清液轉移至超高速離心管中，4 ℃條件下，15 000g離心60 min，棄上清液，底部粉紅色沉淀即為微粒體組分。按照每克肝加懸浮緩沖液1 mL震蕩混合后，分裝于管中，-80 ℃冰箱貯藏備用。

1.6 蛋白含量的測定

采用BCA法測定肝微粒體蛋白總含量。配制BCA 工作溶液，牛血清白蛋白(BSA)標準溶液，制備標準曲線，依據標曲，計算樣品蛋白含量。

1.7 鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的測定

通過測定紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性反映CYP3A酶活性，具體方法參照文獻[13]。酶活性以pmol甲醛/(min·mg)蛋白表示。

1.8 CYP3A mRNA相對表達水平的檢測

利用動物組織/細胞總RNA提取試劑盒迅速提取鯽肝臟中的RNA，用紫外分光光度計測OD260/OD280比值檢驗RNA產量和純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存備用。qRT-PCR反應采用Qtower 2.2(Analytik Jena AG，German)，具體操作參照2×SYBR qPCR Mix試劑盒操作說明進行。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環次數40次，溫度以1 ℃/10 s的速率從65 ℃緩慢遞增到95 ℃，連續測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。利用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量(ΔCt=目的基因Ct平均值-內參Ct平均值；ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt)。

1.9 CYP3A蛋白相對表達水平的檢測

利用差速離心法制備的肝微粒體蛋白經SDS-PAGE進行初步分離，切下目的條帶，通過電轉移到PVDF膜上(轉膜條件：GAPDH: 200 mA，90 min；CYP3A4：200 mA，120 min)，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h，用封閉液稀釋相應的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜(GAPDH：1∶1 000；CYP3A4：1∶1 000)，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1∶50 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應數分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.10 數據分析

以上結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 22.0軟件進行多組間均數比較，采用單因素方差分析，當P<0.05時表示實驗組與對照組有顯著性差異，則進一步采用Duncans test 進行檢驗比較，當P<0.01時表示實驗組與對照組有極顯著性差異。圖形處理使用GraphPad Prism 5.0軟件。

2 結果與分析

2.1 辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的影響

辛硫磷對鯽肝微粒體中的CYP3A酶活性影響見圖1，結果顯示，辛硫磷對CYP3A酶活性整體上呈現較為明顯的抑制作用。染毒后24 h和72 h呈現明顯的劑量效應關系，隨染毒濃度的增加，活性抑制作用愈加明顯，與對照組相比，染毒后24 h，高濃度組的酶活性降低了29.6%，差異極顯著；染毒后72 h，中、高濃度組酶活性分別降低了25.8%和38.6%，差異極顯著。染毒后48 h，相比對照組，CYP3A酶活性表現為在低濃度時受到顯著抑制，而在中、高濃度組間無顯著差異；染毒后96 h無顯著劑量效應，低、中濃度組相比對照組無顯著差異，但在高濃度組間抑制作用明顯，酶活性降低了52.6%。

圖1 辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的影響(n=3)Fig.1 Effect of phoxim on CYP3A activity in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)“*”表示與同一天的對照組(0 mg/L)相比差異顯著(P<0.05)；“**”表示與同一天的對照組(0 mg/L)相比差異極顯著(P<0.01)。圖2、圖3同。

2.2 辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A mRNA相對表達的影響

辛硫磷對鯽肝微粒體中的CYP3A mRNA相對表達的影響見圖2，結果顯示，辛硫磷能降低鯽肝微粒體中的CYP3A mRNA的表達量。整體上，均不存在明顯的劑量效應關系，染毒后24 h，相比對照組，低、高濃度組CYP3A mRNA的下調作用極顯著，分別下調了35.9%和65.5%，而在中濃度組染毒時無顯著差異。染毒后48 h僅在低濃度組時相較對照組存在極顯著差異，中、高濃度組無顯著差異。辛硫磷染毒后72 h及96 h，相比各對照組，各濃度組間都存在極顯著差異，72 h后，低、中、高濃度組CYP3A mRNA表達分別下調了81.7%、56.2%、89.4%；96 h后，低、中、高濃度組CYP3A mRNA表達分別下調了66.1%、77.2%、73.4%。

圖2 辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A mRNA相對表達的影響(n=3)Fig.2 Effect of phoxim on CYP3A mRNA expression in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)

2.3 辛硫磷對鯽肝微粒體中蛋白相對表達的影響

辛硫磷對鯽肝微粒體中的CYP3A蛋白表達量的影響見圖3、圖4，結果顯示，辛硫磷能降低鯽肝微粒體中的CYP3A蛋白的表達量，并且在各染毒時間組中皆呈現明顯的劑量效應關系，辛硫磷濃度越高，表達量越低。相較其他時間組，染毒后24 h，CYP3A蛋白表達量的抑制作用更顯著，低、中、高濃度組的表達量分別下降了21.8%、42.5%、62.3%；48 h后，相比對照組，低、中濃度組的蛋白表達量無顯著差異，但高濃度組存在顯著抑制的現象，表達量降低了48.9%；染毒后72 h和96 h的情況類似，CYP3A蛋白的表達量都在中、高濃度組表現為顯著差異，在低濃度染毒時不存在顯著差異。

圖3 辛硫磷對鯽肝微粒體中CYP3A蛋白相對表達的影響(n=3)Fig.3 Effect of phoxim on CYP3A protein expression in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)

圖4 辛硫磷暴露下鯽肝微粒體CYP3A及GAPDH的western blot結果Fig.4 Western blot results of CYP3A and GAPDH in livermicrosomes of C.auratus gibebio exposed to phoxim

3 討論

CYP3A作為占據CYP450酶含量最多的一類重要亞型，參與眾多內、外源性物質的代謝和調控作用，調節機體的生理功能。辛硫磷作為一種在漁業生產中被廣泛使用的農藥，主要用來殺滅漁業害蟲和魚類寄生蟲，對高等動物低毒，但對魚類具有一定的毒性[14]?，F階段研究主要集中于辛硫磷對動物機體造成的神經毒性和生殖毒性上。研究顯示不同濃度的辛硫磷會對中華稻蝗的乙酰膽堿酯酶(AChE)、酯酶(EST)活性及抗氧化系統產生影響，氧自由基的形成可能是辛硫磷毒性的一個因素[15]；孟順龍等[16]研究表明辛硫磷對羅非魚的超氧化物歧化酶活性有顯著抑制效應。

本研究顯示，辛硫磷能夠抑制鯽肝微粒體中CYP3A的酶活性、mRNA和蛋白的表達量，其對活性的抑制作用與CYP3A mRNA和蛋白的表達量減少存在一定的關聯。不同時間的辛硫磷染毒對CYP3A酶活性的抑制程度不同，但在整體上無明顯的時間效應關系。

就CYP3A mRNA的表達水平與酶活性關系而言，染毒后48 h的不同濃度組間，24 h和72 h時的中、高濃度組間，CYP3A的轉錄水平及酶活性變化表現為很強的一致性，說明辛硫磷可通過影響CYP3A的mRNA轉錄從而導致相應蛋白表達量的減少，最終使得CYP3A的酶活性受到抑制，這與黃連素對鯽[10]及諾氟沙星對劍尾魚[17]CYP3A mRNA轉錄和酶活性的抑制關系影響類似。辛硫磷對鯽肝臟CYP3A轉錄水平的影響可能涉及對動物CYP3A轉錄調控PXR(孕烷X受體)代謝途徑的參與。PXR能夠結合并激活來自多個物種的CYP3A基因啟動子中的特異性反應元件的轉錄[18]。研究表明核受體蛋白PXR會介導小鼠腦微血管內皮細胞[19]、食蚊魚肝臟[20]、海鯛肝細胞[21]CYP3A基因的轉錄。Ding等[22]研究發現炎癥反應期間肝細胞PXR介導的CYP3A的調節機制可能是通過改變一種或多種PXR蛋白共因子復合物的磷酸化狀態，從而激活蛋白激酶C(PKC)信號通路進而抑制PXR的活性。但就本實驗結果而言，也存在其他時間濃度組間mRNA表達量與酶活性變化不完全同步的現象，這可能是由于鯽體內存在其他轉錄水平上的調節作用，諸如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARA)、維生素D結合受體(VDR)、組成型雄烷受體(CAR)等參與動物肝臟CYP3A的轉錄調節[23]。

就CYP3A mRNA的表達水平與其蛋白表達量關系而言，基本不存在相一致的對應關系，這可能是因為特定基因的mRNA豐度不一定與其翻譯產物蛋白質的表達量呈線性關系，基因表達的調控除了轉錄水平的調控，還存在轉錄后調控和翻譯，過程中的mRNA的降解、蛋白的降解等因素都可能導致mRNA豐度與蛋白表達水平不一致[24]。CYP3A蛋白的表達水平基本呈現較強的劑量與時間效應，并且CYP3A蛋白的表達量在24、72和96 h染毒后與其酶活性的影響基本一致，這說明辛硫磷對CYP3A酶活性的影響與其最終的蛋白表達量有關，但在48 h后兩者存在負相關的現象，這可能是由于在此期間存在蛋白質的翻譯后修飾的作用。諸如磷酸化、硝基化、泛素化等蛋白質翻譯修飾作用都會對CYP450酶的活性產生影響[25]。關于辛硫磷對鯽肝臟CYP3A表達中可能涉及到轉錄因子介導的代謝通路的變化及蛋白質翻譯后修飾作用的影響有待后續深入研究。