玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒的制備與表征

焦 巖 韓 赫 常 影 李 沖 高建偉GAO Jian-wei

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

玉米醇溶蛋白(Zein)來自于玉米淀粉加工的副產物玉米黃粉中[1]。Zein的氨基酸組成具有特殊性，因Zein分子中有 50%以上的疏水氨基酸使其具有兩親性，并具有獨特的自組裝特性。以Zein為載體不僅能夠通過包埋與載運植物香精、功能油脂而提高功能性成分的穩定性，而且能夠起到增加溶解性和控釋性等方面的作用。應用反溶劑法可以制備Zein納米粒，其原理為利用溶劑的極性變化改變Zein的構象，并輔助機械方法制備成納米結構體系[2]。例如，Chuacharoen等[3]制備了玉米醇溶蛋白負載β-胡蘿卜素納米粒，提高了β-胡蘿卜素的化學穩定性和在胃腸液環境下的抗氧化活性，效果優于β-胡蘿卜素乳化液；玉米醇溶蛋白還可用于番茄精油的微膠囊壁材，可以防止番茄紅素在儲存過程中的降解，并防止番茄紅素在胃液環境中過多的釋放[4]；Hu等[5]采用超臨界二氧化碳法制備葉黃素/玉米醇溶蛋白納米粒，可對葉黃進行有效包埋并顯示出良好的控釋效果。因此，玉米醇溶蛋白可以作為有效活性成分的載體，用于體內外輸送和提高其穩定性能。

葉黃素屬于類胡蘿卜素。葉黃素可以保護視網膜色素上皮細胞(RPE)免受光氧化，并減少年齡相關性黃斑變性疾病(AMD)，還可預防心腦血管疾病、減少輻射損傷和減少癌癥等多種疾病的發生[6-8]。但是葉黃素化學結構不穩定，容易受到光、熱、氧化等作用而被降解，而且葉黃素水溶性低，不易被體內消化吸收，限制了葉黃素在食品和醫藥領域的應用[9]。

研究[10]表明，玉米醇溶蛋白可以與活性物質通過自組裝作用形成納米復合物，改善穩定性和生物活性。本試驗擬通過玉米醇溶蛋白的載體作用將葉黃素進行包埋與組裝，制備成納米結構體系，并解析其結構表征，旨在為拓展葉黃素在食品和醫藥領域的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素：純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司；

玉米醇溶蛋白：美國Sigma公司；

無水乙醇、石油醚、NaH2PO4、Na2HPO4：分析純。

1.2 儀器與設備

透射電子顯微鏡：F30型，美國FEI公司；

粒徑分析儀：Nano-Zs90型，德國新帕泰克有限公司；

電子天平：JA2003型，上海良平儀器儀表有限公司；

旋轉蒸發儀：RE2000E型，西安太康生物科技有限公司；

紫外分光光度計：UV2450型，日本島津公司；

磁力加熱攪拌器：CJJ-931型，常州萬達升實驗儀器有限公司；

離心機：TDL-5-A型，上海安亭科學儀器廠；

微型旋渦混合器：WXH型，上海躍進醫療器械廠；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum One型，美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒(Zein-Lutein)的制備 采用反溶劑法制備Zein-Lutein納米粒[11]。將葉黃素晶體加入到85%乙醇溶液中超聲溶解得到葉黃素原液，取等體積的玉米醇溶蛋白乙醇溶液按一定比例混合，將葉黃素原液和玉米醇溶蛋白混合溶液磁力攪拌混合均勻，然后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液注入到等體積磷酸鹽緩沖液中，調整pH并在一定溫度下攪拌水合，然后經旋轉蒸發除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。

1.3.2 葉黃素標準曲線的制作及含量的測定 將梯度濃度的葉黃素制備成標準液，在最大吸收波長445 nm處測定吸光值，制作葉黃素標準曲線如圖1所示。

經過繪制標準曲線計算得到葉黃素的含量與吸光值關系的標準方程為y=0.176 3x+0.004 4(R2=0.999 1)。表明葉黃素的含量與吸光值呈良好的線性關系[12]。

圖1 葉黃素標準曲線Figure 1 The standard curve of Lutein

1.3.3 包封率的測定 取3.0 mL上述方法制備的Zein-Lutein溶液，加入3 mL石油醚震蕩混勻1.0 min，在3 000 r/min 離心轉速下離心5.0 min，重復試驗操作3次，回收上清溶液在445 nm處測吸光值，根據標準曲線計算葉黃素溶液濃度，并根據式(1)計算包封率[13-14]。

(1)

式中：

EE——包封率，%；

C——黃素溶液濃度，μg/mL；

M——葉黃素總量，μg；

V——Zein-Lutein納米粒的總體積，mL。

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1.3.4 玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒 (Zein-Lutein)制備單因素試驗

(1)水合時間對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素按質量比20∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在50 ℃下攪拌水合30，60，90，120，150，180 min，然后經旋轉蒸發除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究水合時間對葉黃素包封率的影響。

(2)溫度對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素按質量比20∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在40，45，50，55，60，65 ℃下攪拌水合120 min，然后經旋轉蒸發除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究溫度對葉黃素包封率的影響。

(3)玉米蛋白與葉黃素質量比對Zein-Lutein制備效果的影響：將玉米醇溶蛋白與葉黃素分別按質量比5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1混合均勻，3 000 r/min離心5 min，取上清液注入到等體積pH 4.0磷酸鹽緩沖液中，在55 ℃下攪拌水合120 min，然后經旋轉蒸發除去乙醇，得到Zein-Lutein納米粒溶液。按上述方法測定包封率，研究玉米蛋白與葉黃素質量比對葉黃素包封率的影響。

1.3.5 玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒制備正交試驗

在單因素試驗的基礎上選取水合時間、溫度和玉米醇溶蛋白與葉黃素質量比3個主要的影響因素，以包封率為指標，采用正交試驗設計，分別對Zein-Lutein納米粒制備工藝進行優化。

1.3.6 Zein-Lutein粒徑和電位的測定 取上述方法制備的Zein和Zein-Lutein樣品溶液，適當調整濃度后取1.0 mL 置于Nano-90粒徑分析儀樣品池中進行分析，得到Zein和Zein-Lutein的粒徑和電位分布圖譜[15]。

1.3.7 透射電子顯微鏡(TEM)觀察 通過TEM觀測Zein和Zein-Lutein納米顆粒的形態和結構。將2 μL樣品放置在具有碳膜的400目的銅格柵上，并用紅外燈烘干載Zein和Zein-Lutein納米顆粒的銅格柵，15 min后通過TEM進行觀察其形態和微觀結構[16]。

1.3.8 傅里葉紅外光譜(FT-IR)分析 將葉黃素和Zein-Lutein納米樣品溶液在真空冷凍干燥機中進行干燥。收集干燥樣品在FT-IR中壓片，在4 000～500 cm-1波數范圍測定紅外光譜，并對不同樣品的紅外光譜圖進行分析比較[17]。

1.3.9 數據分析 所有試驗均進行3次平行試驗，數據分析采用 SPSS 10.0和Excel軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 Zein-Lutein納米粒的制備單因素試驗

2.1.1 水合時間對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖2可以看出，隨著水合時間的延長，Zein與Lutein結合程度增加，導致對葉黃素包封率增大，Zein與Lutein充分水合120 min后形成的納米粒對葉黃素的包封率達到最大，且能夠均勻分散在水中形成納米分散體系，當水合時間繼續增加時，包封率趨于平穩，因此水合時間120 min時效果最佳。

圖2 水合反應時間對包封率的影響Figure 2 Effects of hydrolyzed reaction time on entrapment efficiency

2.1.2 溫度對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖3可以得出，隨著制備溫度升高Zein對Lutein包封率增大，在40～55 ℃時增加的趨勢比較明顯，當溫度超過55 ℃時包封率變化呈下降趨勢。因為Zein在加熱的條件下對Lutein能夠較好包埋形成納米結構，當溫度超過55 ℃時，蛋白質開始變性且容易聚集，且高溫會導致葉黃素發生損失，使得對葉黃素的包封率下降，因此55 ℃為最適溫度。

圖3 制備溫度對包封率的影響Figure 3 Effects of prepared temperature on entrapment efficiency

2.1.3 玉米蛋白與葉黃素質量比對Zein-Lutein制備效果的影響 由圖4可知，隨著Zein與Lutein的質量比增大，葉黃素包封率增大，質量比為15∶1時包封率達到最高，當Zein用量繼續增加時，包封率不再增加，是因為過量的Zein在溶液中容易聚集，導致對Lutein包封效率略有下降，因此Zein與Lutein質量比為15∶1時效果最佳。

圖4 玉米蛋白與葉黃素質量比對包封率的影響Figure 4 Effects of Zein and Lutein ratio on entrapment efficiency

2.2 正交試驗

按上述方法進行正交試驗，優化Zein-Lutein制備的最佳條件，正交試驗設計及分析結果如表1和表2所示。

表1 正交試驗設計表Table 1 The orthogonal array design

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal array experimental results

從表2可知，玉米醇溶蛋白對葉黃素包封率影響因素大小順序為C(玉米醇溶蛋白與葉黃素質量比)>A(水合時間)>B(溫度)，最優組合為A2B1C2。將A2B1C組合進行了3次平行驗證實驗，得到的平均包封率為80.23%，小于正交試驗A3B1C3組合中的81.0%，說明A3B1C3組合優于A2B1C2組合。因此可確定玉米醇溶蛋白與葉黃素質量比為20∶1，水合時間150 min，水合溫度50 ℃條件下玉米醇溶蛋白對葉黃素的包封率最大，制備效果最佳。

2.3 Zein-Lutein粒徑和電位分析

2.3.1 Zein-Lutein粒徑分析 采用Nano-Zs 90粒徑分析儀測得Zein和Zein-Lutein的粒徑大小分布如表3所示，可以看出Zein粒徑大小分布，顆粒度大小在171.0～741.9 nm范圍內的比例分別為：0.4%，2.0%，5.2%，9.3%，13.5%，16.4%，17.1%，15.1%，11.1%，6.1%，2.0%。平均粒徑為(482.20±8.25)nm。而Zein-Lutein顆粒度大小范圍主要分布在198.0～859.2 nm范圍(表4)，比例分別為：1.3%，4.1%，8.1%，12.1%，15.1%，16.4%，15.5%，12.7%，8.7%，4.6%，1.5%，平均粒徑為(398.3±5.42)nm。由上述粒徑的測定結果可知，Zein與Zein-Lutein納米粒粒徑分布具有一致性，均在納米級范圍內，且分布比較集中和均勻(如圖5所示)。Zein-Lutein顆粒大小分布變化較小，但所形成的納米顆粒粒徑略有減小，可能是Zein和葉黃素二者通過吸附和疏水部位緊密結合，減小了醇溶蛋白間的疏水性聚集作用，形成納米顆粒后在水中分散性有所改善，因此形成的納米粒徑有所減小[18]。

表3 Zein粒徑分布百分比Table 3 Percentage of particle size of Zein

表4 Zein-Lutein粒徑分布百分比Table 4 Percentage of particle size of Zein-Lutein

圖5 Zein和Zein-Lutein的粒徑分析圖Figure 5 Particle size distribution of Zein and Zein-Lutein

2.3.2 Zein-Lutein電位分析 納米粒子電位分析可反映出包埋前后電勢電位的變化。從圖6可知，玉米醇溶蛋白顆粒的平均電勢為(43.70±2.56)mV，而Zein-Lutein納米粒的平均電勢為(44.30±2.53)mV，電勢電位略有升高，說明帶有正電荷的葉黃素與Zein的結合后，所形成的納米粒帶電荷量增加，進而說明Zein與Lutein能夠有效結合，形成對葉黃素的包埋作用。

2.4 透射電子顯微鏡(TEM)結果與分析

采用H-7650透射電子顯微鏡對Zein和Zein-Lutein微觀結構進行分析。如圖7所示，Zein呈球形顆粒狀態，大小分布比較一致，由于其疏水性較強在溶解液中呈聚集態，蛋白顆粒較大。當Zein對Lutein進行包埋以后，能夠形成Zein-Lutein納米復合體結構，且粒徑變小，大小分布不均勻，與Nano粒徑分析儀測得結果一致。說明脂溶性葉黃素能夠與疏水性玉米醇溶蛋白結合，形成對葉黃素包埋的體系，同時改善了葉黃素的溶解分散性，有效地減小了葉黃素的降解和損失[19]。

圖6 Zein和Zein-Lutein的電勢電位分布Figure 6 Zeta potentiometric of Zein and Zein-Lutein

圖7 Zein和Zein-Lutein的透射電子顯微鏡圖Figure 7 Transmission electron microscope (TEM) of Zein and Zein-Lutein

2.5 傅里葉紅外光譜(FT-IR)解析

由圖8(a)可知，葉黃素在2 957 cm-1波數處有O—H伸縮振動吸收峰，在2 920，2 848 cm-1波數處有C—H伸縮振動吸收峰，在1 715 cm-1波數處有C═C伸縮振動吸收峰，此紅外光譜為葉黃素分子基團的特征吸收光譜[20]。圖8(b)顯示出玉米醇溶蛋白的紅外特征吸收光譜：分別在3 406 cm-1波數處有O—H振動吸收峰，1 656 cm-1處有酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動，2 920 cm-1波數處有C—H伸縮振動吸收峰，在1 115 cm-1波數處有C—O伸縮振動的紅外特征吸收峰[21]。葉黃素經玉米醇溶蛋白包埋后[圖8(c)]，分別在2 957，2 918，2 848，1 715 cm-1波數有特征伸縮振動吸收峰，該特征光譜證明了在玉米醇溶蛋白負載的納米粒中存在葉黃素結構。而且在3 406 cm-1波數處O—H伸縮振動，2 920 cm-1波數處C—H伸縮振動和1 115 cm-1波數處有C—O伸縮振動吸收峰分別明顯增強。且在3 406 cm-1處的O—H伸縮振動峰移至3 422 cm-1處，在1 115 cm-1處的C—O伸縮振動吸收峰移至1 118 cm-1處。上述結果表明，葉黃素與玉米醇溶蛋白結合以后，并未明顯改變Zein的二級結構，而是二者通過O—H鍵和C—O等疏水性基團相互作用結合在一起，加強了葉黃素與Zein分子間的相互作用而形成納米結合體結構[22]。因此，葉黃素與玉米蛋白是以包埋方式結合而形成的納米結構體系。

圖8 葉黃素、Zein和Zein-Lutein的紅外光譜圖Figure 8 Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR)of Zein-Lutein

3 結論

本研究對反溶劑法制備玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒的工藝進行了探討，并對其結構表征進行了初步解析。得到了玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒的最佳制備工藝條件為：玉米醇溶蛋白與葉黃素質量比20∶1，水合時間150 min，溫度50 ℃，此條件下玉米醇溶蛋白對葉黃素的包封率最大為81.0%。通過粒徑分析儀測得所制備的玉米醇溶蛋白負載葉黃素納米粒粒徑分布在198.0～859.2 nm，平均粒徑為398.3 nm，平均電勢為44.3 mV；TEM顯示葉黃素充分被包裹在Zein內部而形成納米球形結構，在水溶液體系中分散性提高；通過Zein載入葉黃素后的FT-IR光譜特征證明了葉黃素能夠以氫鍵和疏水性作用嵌入Zein中形成納米結合體，并通過包埋作用對葉黃素進行負載和保護，此納米體系中Zein的二級結構未發生明顯改變。因此，可將可食性的玉米醇溶蛋白作為有效載體制備玉米醇溶蛋白負載葉黃素自組裝納米粒，對葉黃素進行包埋和保護，可提高葉黃素的穩定性和分散性，有助于保護葉黃素的生物活性和吸收利用率[23]。