水解釋放刺梨汁鍵合態香氣化合物及糖基組成解析

彭邦遠 丁小娟 趙澤偉 丁筑紅

(1.興義市農業農村局，貴州 興義 562400；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)系薔薇科薔薇屬落葉灌木，富含黃酮[1]、超氧化物歧化酶[2]、甾醇[3]等生物活性物質，刺梨香氣成分是其品質的重要構成[4]。研究表明，水果中芳香物質主要以游離態和鍵合態形式存在[5]，其中游離態揮發性物質主要用來呈現水果中的香氣，糖苷鍵合態風味前體主要是通過糖苷利用其糖的端基碳原子將苷元或者相對應的配基相連形成[6]，在水果中以非揮發性形式存在[5]。在果實成熟期，水解和高溫等條件下，鍵合態揮發性物質的糖苷鍵斷裂，游離態香氣化合物被釋放進而被感知[7-9]。刺梨汁主要是利用β-葡萄糖苷酶或相應的酸解處理，進而可以得到刺梨風味前體中獨有的鍵合態物質，進而可強化和增強刺梨相關產品的風味品質，該方法已成為水果制品增香的重要途徑。目前，研究者[10-12]已從刺梨中分離鑒定出130余種揮發性成分，主要以醇類、酯類和酸類物質為主。而對刺梨汁中揮發性物質和香氣成分的來源及構成缺乏系統分析，特別是鍵合態香氣成分信息不夠清楚。相關研究表明，鍵合態風味物質的釋放方法中，酶法條件較為溫和且不會導致物質結構變化[13]，所釋放的香氣更能夠呈現水果的特征香氣[14]。本研究利用AmberliteXAD-2樹脂分離鍵合態香氣物質，通過探究β-葡萄糖苷酶與酸解刺梨汁鍵合態風味前體的揮發性物質的組成差異，以及刺梨汁中糖苷鍵合態香氣化合物的糖基組成，以期為刺梨汁及其加工制品的增香調控提供理論依據。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑

刺梨：采摘新鮮且充分成熟的貴農5號品種，產于貴州龍里刺梨種植基地。

C7～C30正構烷烴混合標樣：色譜純，美國Supelco公司；

Almondsβ-D-葡萄糖苷酶(微生物來源)：100 U/g，美國Sigma公司；

鼠李糖、甘露糖、葡萄糖：生化試劑，中國Solarbio公司；

硅藻土：化學純，天津市富宇精細化工有限公司；

正戊烷、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

GC/MS聯用儀：HP6890/5975C型，美國安捷倫公司；

彈性石英毛細管柱：ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫公司；

硅橡膠隔墊：PTFE型，美國安捷倫公司；

手動固相微萃取裝置：2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS型 StableFlex纖維頭，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨汁的制備 刺梨果實經挑選、清洗、去蒂、切分、榨汁，4層紗布粗濾，在4 ℃，12 000 r/min冷凍離心15 min，留上清液備用。

1.3.2 Amberlite XAD-2樹脂柱處理 參照文獻[15]。

1.3.3 刺梨汁鍵合態香氣前體物的提取 將刺梨汁(3 mL/min)上柱靜置吸附10 h，用400 mL去離子水(3 mL/min)洗脫除去水溶性糖、酸等成分；用300 mL乙醚—戊烷(體積比1∶1)(3 mL/min)洗脫游離態組分；用300 mL甲醇(3 mL/min)洗脫鍵合態組分，得洗脫液。利用旋轉蒸發儀在35 ℃將甲醇洗脫液濃縮至干，溶解于pH 5.0，20 mL 0.06 mol/L檸檬酸緩沖液，分3次用120 mL 乙醚—戊烷(體積比1∶1)萃取去除游離態組分，水相備用[16-18]。

1.3.4 刺梨汁鍵合態香氣前體物的酶解 參照文獻[19]。

1.3.5 刺梨汁鍵合態香氣前體物的酸解 將刺梨汁水相中的萃取物用1.0 mol/L HCl調整pH為1.0，沸水浴60 min，在將溶液用1.0 mol/L NaOH調節至中性，分3次用120 mL乙醚—戊烷(1∶1)萃取酸解液，除去鍵合態揮發性物質，水相于旋轉蒸發儀減壓濃縮至干，備用[6,20]。

1.3.6 刺梨汁水解后香氣物質分析 將1.3.4、1.3.5中乙醚—戊烷(體積比1∶1)萃取液，分別用Na2SO4干燥(4 ℃靜置4 h)除水，過濾，濃縮至5 mL，用N2吹至0.5 mL，取20 μL濃縮液，用二氯甲烷定容至1 mL，取1 μL 進樣，供GC-MS分析。

采用“氣味活化值(odor activity value，OAV)”[21-23]明確刺梨汁中主要揮發性物質。氣味活化值指氣味的物質濃度與其閾值的比值，反映各香氣組分對刺梨汁整體香氣的貢獻情況，按式(1)計算：

(1)

式中：

OAV——氣味活化值；

C——化合物在果汁中的絕對濃度；

T——化合物在果汁中的感覺閾值。

OAV值越大，對香氣的貢獻越大。當OAV>1時，為果汁中典型揮發性物質(OAV>10時，為果汁中重要揮發性物質)；當OAV<1時，該化合物對果汁整體香氣無明顯作用。由于本研究樣品包含較多揮發性物質，精確定量非常繁瑣且成本較高，且試驗旨在篩出OAV最高的揮發性物質。因此，可用所測揮發性物質的相對百分含量分析。W按式(2)計算：

W=f×C×100%，

(2)

式中：

W——所測揮發性物質的相對百分含量，%；

f——相對質量矯正因子；

C——化合物在果汁中的絕對濃度。

相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)[21]，樣品中對總體風味貢獻最高的組分ROAV值為100，其他組分(A)則有：

(3)

式中：

ROAVA——A組分的相對氣味活化值；

OAVA——A組分的氣味活化值；

OAVmax——A組分對總體風味貢獻最高值。

由式(1)～(3)可得：

(4)

式中：

Wmax——對刺梨總體風味貢獻最大的組分的相對百分含量，%；

WA——各揮發性物質的相對百分含量，%；

TA——各揮發性物質的相對感覺閾值；

Tmax——各揮發性物質對刺梨總體風味貢獻最大的相應的感覺閾值。

ROAV≥1表示揮發性物質為刺梨關鍵風味物質，0.1≤ROAV≤1表示揮發性物質對刺梨總體風味存在重要修飾作用[24]。

1.3.7 樣品衍生物的制備 參照文獻[25]59-60。

1.3.8 糖標準品衍生物的制備 參照文獻[26]87。

1.3.9 刺梨汁揮發性香氣成分及GC-MS條件

(1)GC條件：色譜柱為ZB-5MSi 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細管柱，柱溫45 ℃(保留2 min)，4 ℃/min升溫至220 ℃ (保留2 min)；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；柱前壓52 538.071 2 Pa，載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣；溶劑延遲時間：1.5 min。

(2)MS條件：EI源為離子源，溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 615 V；接口溫度280 ℃；質量范圍20～450 amu。糖衍生物樣品色譜條件：色譜柱為HP-5MS(5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane)(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，FID檢測器溫度250 ℃，氣化室溫度280 ℃，進樣量1 μL。程序升溫，起始溫度160 ℃，10 ℃/min 升至180 ℃，3 ℃/min升溫至208 ℃(保留2 min)，1 ℃/min升溫至210 ℃(保留4 min)。

1.3.10 酶解酸解刺梨汁鍵合態化合物的定性定量分析

運用計算機譜庫(Nist/Wiley)將檢測結果進行初期檢索，參照相關文獻資料定性，確定其分子式。其相對含量采用峰面積歸一法確定[27]。

1.3.11 數據統計分析 試驗數據結果用Excel 2010軟件統計，HPLC及GC-MS結果由SPSS 20.0進行相關統計分析。

2 結果與分析

2.1 酶法及酸法釋放刺梨汁鍵合態揮發性物質結果分析

由圖1～2和表1可知，刺梨汁鍵合態底物經酶解、酸解共檢出49種揮發性物質，β-葡萄糖苷酶水解得到31種揮發性物質，酸類10種(25.78%)、醛類3種(19.96%)、醇類7種(16.79%)、酮類4種(13.38%)、酯類3種(11.03%)、酚類1種(7.14%)、烯烴類2種(3.46%)、呋喃1種(0.16%)，含量較高的物質有乙醛(9.78%)、硬脂酸(9.68%)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮(8.78%)、乙酸乙酯(8.37%)、愈創木酚(7.14%)等。酸解釋放24種揮發性物質，呋喃1種(0.57%)、酸類3種(0.83%)、醇類2種(1.14%)、酯類2種(1.25%)、烯烴類7種(3.36%)、酮類2種(18.59%)、酚類7種(53.23%)，含量較高的物質有2,6-二叔丁基對甲酚(49.55%)、胡薄荷酮(13.71%)、5-己烯-2-酮(4.88%)、5-甲基間苯二酚(2.03%)、α-無水葡萄糖酯(1.10%)。酸解和酶解對釋放刺梨汁鍵合態風味前體物質有較大差異，共同的風味物質分別為肉桂酸、棕櫚酸、油酸、胡薄荷酮、2,3-二氫-2-甲氧苯并呋喃。風味前體水解物的不同主要與糖苷類前體的斷鍵方式存在相關性，酶解反應主要斷糖苷鍵，而酸解反應斷醚鍵[28]。酸解反應在高溫條件下斷鍵更徹底，酶解依賴于酶的種類及活性。酶解主要釋放酸類、醛類、醇類物質，醇、醛類物質呈青草味，酸解主要釋放烯烴類、酮類及酚類物質，酮、酚類物質呈果香味，烯烴類物質有花香味[26]5-7。酶解釋放的香氣物質更接近刺梨自身香氣，起增香作用[26]93。酸解反應條件影響香氣穩定性，且酸解無選擇性，易產生刺激性甚至異味成分[29]。研究發現經酸水解，在刺梨汁中得到風味前體有二氫月桂烯醇、芐醇、4-甲基辛烷、5-己烯-2-酮、胡薄荷酮、1,3,5,5-四甲基-1,3-環己二烯、十六烷、二十二烷、二十五烷等。經酶解得到風味前體有丙酮醇、3-羥基丁醛、羥基香茅醛、丁酸、己酸等。本研究發現經水解后得到風味前體有葉醇、蘑菇醇、D-異薄荷醇、肉桂酸、對羥基肉桂酸、棕櫚酸、2-更酮、乙酸乙酯、愈創木酚，本研究和周志[11]、彭邦遠等[12]的研究結果一致。

圖1 刺梨汁鍵合態揮發性物質的酶解產物GC-MS總離子流圖Figure 1 GC-MS total iol current chromatogram of the bond flavor components enzymolysis products in Rosa roxburghii juice

圖2 刺梨汁鍵合態揮發性物質的酸解產物GC-MS總離子流圖Figure 2 GC-MS total iol current chromatogram of the bond flavor components acidolysis products in Rosa roxburghii juice

表1酶解與酸解法刺梨汁鍵合態揮發性物質比較
Table 1The Comparison of Enzymatic Hydrolysis and Acidolysis of bond flavor components inRosaroxburghiijuice

物質種類化合物相對含量/%酶解酸解物質種類化合物相對含量/%酶解酸解醇類乙醇4.64-二氫月桂烯醇-0.39丙酮醇0.16-芐醇0.500.75葉醇4.58-β-桉葉醇4.04-蘑菇醇1.71-D-異薄荷醇1.16-醛類乙醛9.78-3-羥基丁醛5.53-羥基香茅醛4.65-酸類丁酸0.18-己酸6.73-3-羥基丁酸0.45-苯乙酸2.14-肉桂酸1.500.22對羥基肉桂酸1.35-棕櫚酸2.100.47油酸0.250.14硬脂酸9.68-3,4-二甲基肉桂酸1.40-酮類4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮8.78-5-己烯-2-酮-4.88胡薄荷酮2.4613.712-庚酮0.34-烯烴類1,3,5,5-四甲基-1,3-環己二烯-0.98反式-β-羅勒烯3.35-烷烴類十四烷0.11-十七基環己烷-0.114-甲基辛烷-0.39十六烷-0.73二十一烷-0.31二十二烷-0.39二十五烷-0.46酯類檸檬酸三乙酯2.41-乙酸乙酯8.37-α-無水葡萄糖酯-1.10苯二甲酸丁酯0.25-棕櫚酸乙酯-0.15酚類苯酚-0.204-丙基苯酚-0.062,6-二叔丁基對甲酚-49.554-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚-0.825-甲基間苯二酚-2.032,4-二氨基苯酚-0.28愈創木酚7.14-4-甲基-6-叔丁基苯酚-0.28其他樟腦1.75-2,3-二氫-2-甲氧苯并呋喃0.160.57

2.2 酶解與酸解法釋放刺梨汁鍵合態典型風味化合物差異性分析

由表2可知，酸類、酚類物質閾值較高，飽和烷烴為揮發性非嗅感物質，不易引起嗅感[29]對特征風味貢獻較小。經β-葡萄糖苷酶水解得到β-桉葉醇(ROAV=1.84)、3-羥基丁醛(ROAV=2.52)及愈創木酚(ROAV=1.84)3種物質ROAV>1，可能為酶解刺梨汁鍵合態風味物質的重要香氣成分。乙醛(ROAV=0.30)對酶解液整體風味具有重要的修飾作用。酸解法主要釋放的物質為酸類和酯類，棕櫚酸閾值為10 000 μg/kg，棕櫚酸乙酯閾值為2 000 μg/kg，苯酚、4-丙基苯酚閾值分別為5 900，55 μg/kg，均為非嗅感物質對風味貢獻較小。4-丙基苯酚ROAV<0.1，對刺梨汁整體香氣貢獻較小。綜上可知，酶解法釋放揮發性風味物質多于酸解法，酶解后對刺梨汁風味影響較大的風味物質(ROAV≥1)有4種，其貢獻順序為：3-羥基丁醛>β-桉葉醇>愈創木酚>羥基香茅醛；酸解法釋放的揮發性物質對風味貢獻不明顯。

酶具有專一性和高效性，能夠催化葡萄糖的半縮醛羥基和其它物質羥基相連的糖苷鍵[30]，通過移除香味前體的相應糖配體釋放揮發性物質，而酸解法使糖苷鍵的成鍵原子質子化形成陽離子中間體，減少空間張力致糖苷鍵斷裂釋放配基[31]，使其更易于被酸水解。酸解反應較劇烈，釋放風味成分不足，刺激性氣味較重[25]47。

? “ND”表示酶解未檢測到而酸解檢測到的化合物或酸解未檢測到而酶解檢測到的化合物。

2.3 刺梨汁鍵合態揮發性物質的糖基成分分析

利用三氟乙酰化法，對鍵合態糖苷糖基進行探究，能夠較明確地得到糖苷和糖基的結構[29]。由圖3～6可知，在相同GC-MS條件下混合糖標品中鼠李糖、甘露糖、葡萄糖保留時間為12.674，7.301，12.945 min，與單糖相比在相同檢測條件下，各保留時間的標準差均小于±0.038，因此，峰的保留時間可用于刺梨汁糖基的鑒定。由圖7～8可知，酶解法可釋放的刺梨汁鍵合態香氣組分含有兩種糖基，保留時間分別為12.767，13.094 min，與鼠李糖(12.674 min)、葡萄糖(13.097 min)保留時間相符合，根據保留時間定性進行GC-MS分析及參考相關文獻，可初步確認酶解法能夠得到刺梨汁鍵合態風味物質中糖基由葡萄糖、鼠李糖組成。酸解法可釋放的刺梨汁鍵合態風味物質的糖基有3種，保留時間分別為12.784，13.107，7.482 min，與鼠李糖(12.674 min)、葡萄糖(13.097 min)、甘露糖(7.346 min)保留時間相符合。初步判定，刺梨汁中鍵合態香氣物質的糖基由葡萄糖、鼠李糖、甘露糖組成。酶解與酸解刺梨鍵合態風味前體糖基有差異，共同可釋放的糖基為葡萄糖與鼠李糖。宛曉春等[32]采用HPLC檢測到酸解后檸檬汁中糖苷鍵合態揮發性物質的糖基部分可能由葡萄糖和鼠李糖組成。奕志英等[19]采用HPLC檢測到酶解后石榴汁中糖苷鍵合態香氣前體物質的糖基主要以葡萄糖和果糖為主。目前鑒定出糖苷的糖基部分一般含有葡萄糖、鼠李糖、甘露糖等單糖[33-34]，大多數鍵合態風味物質與葡萄糖鍵合[35]。

圖3 鼠李糖的離子流圖Figure 3 GC-MS chromatogram analysis of Rhamnose

圖4 葡萄糖的離子流圖Figure 4 GC-MS chromatogram analysis of Glucose

圖5 甘露糖的離子流圖Figure 5 GC-MS chromatogram analysis of Mannose

圖6 葡萄糖、甘露糖、鼠李糖等混合標品的離子流圖Figure 6 GC-MS chromatogram analysis of Galactose,Xylose,Glucose,Mannose,Fructose,Rhamnose

圖7 刺梨汁酶解糖基衍生化離子流圖Figure 7 GC-MS chromatogram of Rosa roxburghii juice enzymatic Glycosylation

圖8 刺梨汁酸解糖基衍生化離子流圖Figure 8 GC-MS chromatogram of Rosa roxburghii juice acidolysis Glycosylation

3 結論

采用β-葡萄糖苷酶水解刺梨汁鍵合態香氣前體物質，共得到49種揮發性物質，酶解釋放31種揮發性物質，其中乙醛(9.78%)、硬脂酸(9.68%)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮(8.78%)、乙酸乙酯(8.37%)、愈創木酚(7.14%)等含量較高。酸水解得到24種揮發性物質，其中2,6-二叔丁基對甲酚(49.55%)、胡薄荷酮(13.71%)、5-己烯-2-酮(4.88%)、5-甲基間苯二酚(2.03%)、α-無水葡萄糖酯(1.10%)含量較高。酸解與酶解釋放的香氣物質不同，可能與反應強度和水解機制有關。

經ROAV值分析，刺梨汁酶解液中典型揮發性物質多于酸解液，酶解后對風味影響較大的典型風味物質(ROAV≥1)有4種，貢獻順序為3-羥基丁醛>β-桉葉醇>愈創木酚>羥基香茅醛；酸解后對風味影響的重要風味物質少，可能與酸解條件及反應劇烈程度有關。通過衍生化法探究刺梨汁鍵合態香氣前體酶解與酸解法可釋放的糖基，得出不同水解法可釋放的糖基不同，本研究初步確定刺梨汁鍵合態香氣前體物質的糖基有葡萄糖、鼠李糖和甘露糖。