核桃粕中環烯醚萜苷提取分離與抗疲勞活性研究

金 蒙 徐德平 詹 積 陳 晨

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃、合桃等，系胡桃科植物胡桃的干燥果實[1]，含蛋白質、碳水化合物、脂肪等多種成分[2-3]?，F代醫學研究[4-8]表明，核桃具有健腦益智、降血脂、抗氧化、降血糖、補腎固精、抗疲勞等多種功效。

核桃粕是核桃榨油后的餅粕，富含蛋白質、維生素等營養物質，大多用作飼料，僅少量用于生產核桃蛋白粉等初級產品，造成資源浪費[9]。樊永波等[10]研究表明，影響大鼠學習、記憶和抗氧化功能的主要成分存在于核桃粕中。烏蘭等[11]發現核桃粕中的核桃肽可提高乳酸脫氫酶活性，降低血乳酸和血清尿素氮含量，提高肌糖原儲備量，顯著延長負重游泳時間，具備一定的緩解疲勞的作用。可見對核桃粕功能成分及作用機制的研究十分必要。而目前，中國對核桃的研究主要集中在對核桃油脂的營養價值以及對核桃蛋白的提取工藝方面，對核桃粕功能的研究報道較少，且均為對核桃粕粗提取物的功能研究，有關核桃粕中的功能成分，特別是抗疲勞活性成分目前尚未明確。

本試驗對核桃冷榨粕進行提取分離，擬對核桃提取物的不同萃取物進行抗疲勞作用研究，以確定核桃粕中對補腎固精、抗疲勞的有效成分，以期為核桃粕研究和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

核桃冷榨粕：云南林科院；

無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

ICR小白鼠：雄性，上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.2 儀器與設備

不銹鋼五谷雜糧磨粉機：CLF-250型，浙江省溫嶺市創立藥材器械廠；

雙層玻璃提取罐：RAT-100型，無錫申科儀器有限公司；

旋轉蒸發器：R1005型，上海申順生物科技有限公司；

循環水式多用真空泵：SHZ-95型，上海丞明儀器設備有限公司；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術公司；

電腦全自動部份收集器：DBS-100型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

超聲波清洗器：KQ-250B型，昆山市超聲儀器有限公司；

動物實驗跑臺：BW-TDW709型，上海軟隆科技發展有限公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz，德國Bruker公司；

高壓液相儀：Waters Alliance 1525分離單元，美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃粕提取物與粗分離 稱取核桃粕10 kg，粉碎后過30目篩，置于100 L提取罐中，按1∶10(g/mL)料液比加入體積分數為75%乙醇，60 ℃條件下攪拌提取5 h，過濾取濾液，濾渣重復提取兩次，合并濾液，減壓濃縮至2 L，即為核桃粕乙醇提取物A，保存備用。向核桃粕醇提后的濾渣中加入100 L去離子水，并于60 ℃條件下攪拌提取5 h，過濾，取上清液減壓濃縮至合適體積，即為核桃粕水提物，-18 ℃下保存備用。

取適量核桃粕乙醇提取物于1 000 mL分液漏斗中，按1∶1體積比加入乙酸乙酯，震蕩混勻靜置，反復萃取3次，取乙酸乙酯相濃縮至浸膏狀，即得乙酸乙酯萃取物B，在乙酸乙酯萃取殘余物中再按1∶1體積比加入正丁醇，震蕩混勻靜置，萃取3次，取正丁醇相減壓濃縮至浸膏狀，即得正丁醇萃取物C，低溫保存備用。取適量核桃粕水提物，加入適量無水乙醇至酒精濃度達到70%以上，并且不斷攪拌使得濃縮液充分醇沉，靜置過夜，過濾，濾液相經減壓濃縮至浸膏，得水提醇溶物D，低溫保存備用。

1.2.2 核桃粕不同組分的抗疲勞作用 取3周齡 SPF級雄性ICR小白鼠50只，體重(16.0±2.0)g。適應性喂養1周后，隨機分為空白組與A、B、C、D試驗組，每組10只。用水溶解各提取物，并對試驗組每日給以劑量1.0 g/kg灌胃，小鼠的灌胃體積為0.1 mL/10 g，空白組給等量正常飲用水，連續給藥30 d。

(1)小鼠跑臺試驗：給藥前1周，在喂食30 min后對小鼠進行15 min跑步機適應性訓練；連續給藥，第30天給藥后30 min，對小鼠進行體能測試。小鼠訓練和測試方法如表1，通過逐漸加大速度和坡度的測試方案，最后以20 m/min速度使小鼠奔跑直至力竭。若小鼠落入電擊區，數次電擊后仍無法繼續活動即判定力竭，記錄跑步時間。測試過程中，小鼠若因受電擊離開刺激源，在跑帶上繼續活動，此時通道計時累加。用時到達2 h后，試驗結束。

表1 試驗動物訓練及測試方案?Table 1 Training and measurement plan of laboratory animals

? 10 min之后保持20 m/min速度和10°坡度至結束。

(2)小鼠負重游泳試驗：根據文獻[12-13]修改如下：跑臺試驗測試結束24 h后，再次給藥，30 min后對小鼠進行負重游泳試驗。將小鼠放入水深 35 cm，水溫(25±1)℃的水箱(50 cm×50 cm×50 cm)，鼠尾負5%體重的鉛皮，記錄小鼠放入水箱至水浸沒頭部后持續8 s不能浮出水面的時間，即力竭時間。

1.2.3 核桃粕抗疲勞作用組分的分析 利用HPLC對具有抗疲勞作用的萃取物中化學組成進行分析。色譜條件：色譜柱XBridgeTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈—水溶液(40∶60)；流速1 mL/min；進樣量20 μL。紫外檢測器條件203 nm。

1.2.4 抗疲勞活性組分的分離 將具有抗疲勞活性組分的正丁醇萃取物C取出解凍，過濾，上樣到MCI柱(5 cm×100 cm)，依次用去離子水、體積分數為5%，10%，50%的乙醇進行梯度洗脫，流速10 mL/min，用TLC薄層法跟蹤檢測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應的結果，分析合并相同組分，得到水洗脫物L、5%乙醇洗脫物M和10%乙醇洗脫物N。

1.2.5 抗疲勞活性化合物的化學鑒定 將得到的抗疲勞活性化合物以氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內標物，進行1H NMR、13C NMR等測定。

1.2.6 單體化合物的抗疲勞作用 取3周齡SPF級雄性ICR小白鼠20只，體重(16.0±2.0)g。適應性喂養1周后，隨機分為空白組與試驗組，每組10只。試驗組給單體化合物Ⅱ以每日劑量0.5 g/kg灌胃，小鼠的灌胃體積為0.1 mL/10 g 只，空白組給等量正常飲用水，連續給藥21 d 后，記錄小鼠體重變化，并進行小鼠跑臺試驗和負重游泳試驗，方法同1.2.2。

2 結果與分析

2.1 核桃粕不同組分的抗疲勞作用

由表2可知，各試驗組中，核桃粕正丁醇萃取物組C小鼠體重變化最大，跑臺測試力竭時間和負重游泳力竭時間均為最佳，抗疲勞效果最顯著，且與對照小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而A、B、D組小鼠的體重變化、跑臺測試力竭時間和負重游泳力竭時間與空白組相比均無明顯改善，說明不含抗疲勞活性成分。由此推斷核桃粕醇提物有抗疲勞作用，且有效成分分布于核桃粕醇提物正丁醇萃取物中，故對正丁醇萃取物進一步分離。

表2不同萃取物對小鼠體重、跑臺測試和負重游泳的影響?
Table 2Effects of different extracts on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

組別體重變化/g跑臺測試力竭時間/s負重游泳力竭時間/s對照12.16±14.0673±22.3835±1.89A組16.41±13.14?92±18.33?52±2.95B組13.37±12.3380±22.4244±2.56C組18.46±11.37?98±21.46?59±2.35D組12.77±11.5779±16.7841±2.66

? * 表示與對照組比較P<0.05。

2.2 正丁醇萃取物組成成分

核桃粕抗疲勞有效成分存在于乙醇提取物正丁醇萃取物中，對該萃取物進行HPLC分析，圖1為正丁醇萃取物的HPLC圖譜，圖中主要由4個峰，保留時間分別為2.008，2.949，3.508，4.405 min，說明該部分主要由4種化合物組成。

2.3 抗疲勞作用單體化合物的分離及鑒定

2.3.1 化合物的分離 保留時間為2.008 min 的化合物由于含量較低，未能分離到單體。其他組分分離結果：

(1)水洗脫物L：將L反復上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，用去離子水洗脫，流速10 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法跟蹤檢測洗脫液中的成分，并根據Rf值和顯色反應的結果，分析合并相同組分，得到單體化合物Ⅰ，即為圖1中保留值為2.949 min的化合物。

圖1 正丁醇萃取物液相色譜圖
Figure 1 HPLC ofN-butanol extract

(2)5%乙醇洗脫物M：將M反復上ODS-AQ柱(3 cm×100 cm)，依次用體積分數2%，5%，10%，15%的乙醇溶劑洗脫，流速10 mL/min，自動收集器每管20 mL收集洗脫液，用TLC法檢測其中成分，并據Rf值和顯色反應情況合并相同組分，直至得到單體化合物Ⅱ，即為圖1 中保留值為3.508 min的化合物。

(3)10%乙醇洗脫物N：將N反復上ODS-A柱(3 cm×100 cm)，用體積分數5%，10%，20%，50%的乙醇溶劑洗脫，流速8 mL/min，洗脫液用試管收集，TLC法檢測其成分，并根據結果將相同組分合并，直至得到單體化合物Ⅲ，即為圖1中保留值為4.405 min的化合物。

2.3.2 結構鑒定 有抗疲勞活性組分的正丁醇萃取物經ODS-AQ、ODS-A柱層析分離得到3個化合物，經 TLC法顯色可見化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的單一斑點，均為單一化合物，其化學結構分別為：

(1)化合物Ⅰ：無定形粉沫，易溶于水，微溶于乙醇、甲醇。

從1H-NMR(500 MHz，D2O)可見：δ4.61(1H，d，J=1.2)應為糖上的端基H-1信號，δ3.3～3.8為糖上的其余H信號，δ1.09有1個三峰甲基信號，表明化合物為糖的衍生物；從13C-NMR可見：δ103.5，76.7，74.0，72.1，70.5，61.8，61.3，15.3共8個碳信號，經文獻[14]對比，該化合物為α-乙氧基半乳糖苷。

(2)化合物Ⅱ：無定形粉沫，易溶于水、乙醇、甲醇。其1H-NMR(500 MHz，D2O)和13C-NMR圖譜見圖2，由圖譜可見其無雜峰，為單一化合物。

從圖2(a)可見：δ7.2(1H，s)；δ5.9(1H，s)；δ5.5(1H，s)；δ5.4(1H，d，J=6.0)；δ4.3(2H，dd，J=19.5,43.5)；δ3.9(1H，d，J=15.5)；δ3.7(1H，dd，J=7.0,15.5)；δ3.5(3H，m)；δ3.3(2H，m)；δ3.2(1H，t，J=6.0)。

綜合分析并與文獻[15]對比，該化合物為環戊烯型環烯醚萜苷類化合物，結構為：4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環戊烯環烯醚萜苷，為首次從核桃粕中分離出的物質，化學結構如圖3所示。

(3)化合物Ⅲ：白色無定形粉沫，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇。從1H-NMR(500 MHz，D2O)可見：6.41(1H，d，J=8.0)，6.31(1H，d，J=8.0)，6.29(1H，d，J=8.0)；從13C-NMR 可見：δ146.6，133.4，118.9，107.6共4個碳信號，經文獻[14]對比，該化合物為尿嘧啶。

圖2 化合物Ⅱ的1H-NMR和13C-NMR圖譜Figure 2 1H-NMR and 13C-NMR of Ⅱ

圖3 化合物Ⅱ的化學結構Figure 3 The chemical structures of compounds Ⅱ

2.4 單體化合物的抗疲勞作用

化合物Ⅰ、Ⅲ未有文獻報道其具抗疲勞活性，而化合物Ⅱ為環烯醚萜苷類化合物，此前多有研究[16]報道該化合物具有抗疲勞活性，因此對化合物Ⅱ單體進行抗疲勞評價，其作用如表3所示。

由表3可知，單體化合物Ⅱ組小鼠的體重顯著增加(P<0.05)，跑臺測試力竭時間和負重游泳力竭時間最長，分別為(111±30.44)s和(56±4.87)s，明顯高于對照組(P<0.01)，由此推斷，單體化合物Ⅱ，即4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環戊烯環烯醚萜苷，為核桃抗疲勞的活性成分之一。

表3化合物Ⅱ對小鼠體重、跑臺測試和負重游泳的影響?
Table 3Effect of compound II on body weight,treadmill test and weight-bearing swimming of mice(n=10)

組別體重變化/g跑臺測試力竭時間/s負重游泳力竭時間/s對照組11.22±12.1978±28.2829±3.67化合物Ⅱ組18.94±14.77?111±30.44??56±4.87??

? 與空白對照組比較，* 表示P<0.05；**表示 P<0.01。

3 結論

本研究通過小鼠跑臺試驗和負重游泳試驗，發現正丁醇組小鼠的抗疲勞能力明顯高于乙醇提取組、乙酸乙酯組和乙醇萃取組，說明核桃粕醇提物正丁醇萃取物含有具明顯抗疲勞作用的成分。正丁醇萃取物經MCI柱和ODS柱分離得到的3個主要化合物，經鑒定分別為α-乙氧基半乳糖苷、4-羧基-7-羥基-8-乙酸乙酯基-3,6-環戊烯環烯醚萜苷和尿嘧啶。

本文從核桃中分離到環烯醚萜苷類成分，并經動物試驗表明該成分具有顯著抗疲勞功效，與核桃補腎固精、抗疲勞作用有關。但核桃粕中是否還存在環烯醚萜苷類類似物或其他補腎固精、抗疲勞功效成分還仍需進一步研究明確。