細胞選擇性穿膜肽的穿膜效果研究

譚擁軍 王坤 余靂 黃小芹 陳燕 譚桂湘

摘? ?要：細胞穿膜肽是一類能夠穿透細胞膜并且不損壞細胞膜結構的小分子多肽，該多肽一般由不多于30個氨基酸組成. 針對FITC標記的具有肺癌或肝癌細胞選擇性的兩種穿膜肽，設置不同濃度梯度，分別處理多種腫瘤細胞，熒光顯微鏡下觀察不同作用濃度下細胞中綠色熒光的強弱，并通過流式細胞儀檢測含有熒光的細胞數. 結果表明：兩種細胞穿膜肽具有不同的細胞選擇性. CPP33在作用濃度為10 μmol/L時能觀察到較強的熒光選擇性，流式細胞儀檢測含有熒光的細胞數約大于50%，CPP44在作用濃度為10 μmol/L時能觀察到較強的熒光選擇性，流式細胞儀檢測含有熒光的細胞數約大于60%. 并且隨著作用濃度的增加，兩種細胞中含有熒光的細胞數不斷上升. 因此這種針對腫瘤細胞的選擇性穿膜肽可能為小分子藥物在體內的精確遞送提供一種新的方法.

關鍵詞：腫瘤選擇性穿膜肽;肺癌;肝癌;濃度梯度;小分子藥物

中圖分類號：Q784? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A

Study on Transmembrane Delivery of

Tumour Lineage-homing Cell-penetrating Peptides

TAN Yongjun，WANG Kun，YU Li，HUANG Xiaoqin，CHEN Yan，TAN Guixiang

（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract： Cell penetrating peptides are small molecular peptides that can penetrate cell membranes without damaging the structure of cell membranes. These peptides are generally composed of no more than 30 amino acids. Two tumor lineage-homing cell-penetrating peptides labeled with FITC for lung cancer and liver cancer were synthesized and added to different kinds of tumor cells with different concentration gradients. The number of cells containing fluorescence was detected. The results approved that the two kinds of cell-penetrating peptides showed different cell selectivity. The fluorescence specificity of CPP33 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 50% by Flow cytometer. The fluorescence specificity of CPP44 was strong at the concentration of 10 μmol/L. The number of cells containing fluorescence was about 60% by Flow cytometer. Moreover， the number of cells containing fluorescence increased with the increase of concentration， respectively. In conclusion， these tumor lineage-homing cell-penetrating peptides may provide a new method for precise delivery of anticancer molecules in vivo.

Key words： tumor lineage-homing cell-penetrating peptides;lung cancer;liver cancer;concentration gradient;anticancer molecules

細胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）是一類由氨基酸組成具有穿透細胞膜能力的小分子多肽，其中氨基酸的個數一般不多于30[1-2].CPPs最早從人HIV-Ⅰ的TAT蛋白中發現，該蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段區域蛋白轉導域（protein transduction domains，PTD），該區域是一個包含13個氨基酸可溶性肽段[3-4]. 隨著研究的深入，細胞穿膜肽的數量不斷增加.

CPPs的分類有多種，可以根據其來源或序列的不同分為不同的亞類[5]，還可以依據肽鏈所含脯氨酸的多少分為富含脯氨酸和多脯氨酸兩種[6]，如SAP，該多肽中的脯氨酸含量高達50%. 除此之外，由于不同穿膜肽進入細胞后，會引起細胞內Ca2+的不同變化，可以將細胞穿膜肽分為兩親性和非兩親性，兩親性細胞穿膜肽會引起細胞內Ca2+不同程度的提高，而非兩親性細胞穿膜肽在轉運過程中幾乎不會對細胞內Ca2+產生影響[7]. 不同于普通的分類，還有一種特殊類型的細胞穿膜肽，該類穿膜肽由兩條及以上的肽鏈組成，如轉運蛋白、PEVEC、MAP和PEP-1[8].

近年來，CPPs作為分子載體用于藥物遞送系統的應用已經越來越廣泛.通過融合的方法可以攜帶核酸[9]、蛋白[10]、小分子化合物[11-12]、核磁共振成像載體[13]等進入細胞. Meyer-Losic等[14]將人工合成的一種功能肽DPV1047 Vectocell與SN38通過物理混合的方式制成復合物，通過對溶解性、毒性、穩定性的研究證明其具有很好的抗腫瘤作用，并且在動物實驗上取得明顯的效果.

由于大部分細胞穿膜肽沒有選擇性，因此針對特定細胞的靶向治療還停留在初級階段.并且現有的腫瘤細胞選擇性穿膜肽也是建立通過把已知非選擇性穿膜肽與識別細胞表面抗原的抗體[15]連接或者與其他針對某種細胞的選擇性分子形成復合物產生的，這種連接不僅受到所連分子理化性質的限制，對所針對的腫瘤細胞也具有一定的局限性. 近期Kondo等人[16]通過mRNA展示技術構建多肽文庫，成功獲得了腫瘤選擇性細胞穿膜肽，并利用合成的腫瘤選擇性穿膜肽對比多種不同腫瘤驗證了其選擇性效果.

本文分別研究了肺癌細胞選擇性穿膜肽CPP33、肝癌細胞選擇性穿膜肽CPP44，經FITC標記后，不同作用濃度下，在腫瘤細胞A549和HepG2等5種不同細胞中的細胞選擇性，觀察了不同濃度下細胞內的熒光強弱，通過流式細胞儀分析了不同腫瘤細胞中含有綠色熒光的細胞數目，確認了CPP33、CPP44兩種細胞穿膜肽具有明顯的細胞選擇性.

1? ?材料與方法

1.1? ?材? ?料

乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549、宮頸癌細胞HeLa、骨肉瘤細胞U2OS來源于American Type Culture Collection（ATCC）;DMEM培養基、1640培養基以及血清均為GIBCO公司產品;Flow Cytometer由BECKMAN COULTER公司提供;FITC標記多肽由上海淘普生物科技有限公司合成，序列信息如下：

CPP33： RLWMRWYSPRTRAYG

CPP44： KRPTMRFRYTWNPMK

1.2? ?方? ?法

1.2.1? ?不同濃度腫瘤細胞選擇性穿膜肽顯微觀察

在含有MCF-7、HepG2、A549、HeLa、U2OS 5種腫瘤細胞的10 cm培養盤中加入含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）的DMEM培養液后將培養盤放入37 ℃ 5%CO2培養箱中培養，待細胞密度長至90%時，吸出培養液，用1X無菌PBS漂洗兩次，每盤加入1 mL 1X胰酶放入培養箱中消化2 min，待細胞變圓脫落時，加入1 mL含10% FBS的DMEM培養液輕輕吹打數次至單個細胞，并用培養液配成單個細胞懸液，以每孔1.2×106個細胞接種到6孔板中，每孔總體積為2 mL，放入培養箱中培養.

在超凈工作臺中分別向CPP33、CPP44合成的多肽中分別加入4.22 mL、4.16 mL無菌ddH2O將其稀釋至400 μmol/L.待6孔板中的細胞密度長至70%時，吸出培養液，用無菌PBS漂洗兩次，按終濃度分別為2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L設置濃度梯度，用含FBS培養液按照上述濃度梯度稀釋多肽加入到培養板中. 剩余2孔只加2 mL培養液用作對照，放入培養箱中培養，6 h后觀察細胞的熒光強度，并以穿膜數超過50%為有效穿膜肽統計穿膜率.

1.2.2? ?流式細胞儀檢測細胞熒光

按照上述方法培養細胞，待細胞密度長至90%時，每盤加入1 mL 1X胰酶放入培養箱中消化

2 min，待細胞變圓脫落時，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培養基輕輕吹打數次至單個細胞，并用培養液配成單個細胞懸液，以每孔7 × 106個細胞接種到10 cm培養盤中，每種細胞按照終濃度10 μmol/L加入FITC標記的穿膜肽，6 h后收集細胞.

吸去培養皿中的培養液，用無菌PBS漂洗兩次，加入1 mL lX胰酶，置于培養箱中消化2 min，待細胞變圓脫落時，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培養基輕輕吹打數次至單個細胞.將細胞收集在2 mL Eppendorf管中，4 ℃條件下1 000 r/min離心5 min，去除上清胰酶培養基混合物. 加入PBS漂洗兩次，4 ℃，1 000 r/min離心5 min. 加入1 mL無菌PBS，使其細胞密度為1 × 106/mL，冰上存放用于流式檢測，并取相同培養條件下，未加穿膜肽的細胞作對照.

流式分析，創建Forward Scatter（FSC）vs. Side Scatter（SSC）峰圖，將對照樣品放入“test”管，調節FSC和SSC電壓使細胞集中于FSC vs.SSC 峰圖內. 創建一個門（R1）包括所有的細胞，基于門（R1）創建Fluorescence Channel 1（FL1）vs. SSC 峰圖，調節FL1 PMT電壓值以便DEAB“control”樣品峰分布在102內. 取下對照樣品，換上待檢測樣品，保持參數不變，出現在102以外的Polt即為含綠色熒光的細胞，分析約100 000個細胞，記錄每種細胞中含綠色熒光的細胞比例.

2? ?實驗結果

2.1? ?不同濃度腫瘤細胞選擇性穿膜肽顯微分析

2.1.1? ?不同濃度腫瘤細胞選擇性穿膜肽顯微觀察

對比兩種腫瘤細胞選擇性穿膜肽在5種不同腫瘤中綠色熒光的強弱. 當腫瘤細胞濃度為2 μmol/L時，CPP33和CPP44在5種細胞中幾乎沒有熒光;當腫瘤細胞濃度為5 μmol/L時，5種細胞的綠色熒光亮度有所提高，加有CPP33的細胞中，A549細胞中的綠色熒光亮度最高;加有CPP44的細胞中，HepG2細胞中的綠色熒光亮度最高，兩種穿膜肽在兩種細胞開始出現明顯的選擇性. 當腫瘤細胞濃度為10 μmol/L時，CPP33、CPP44兩種穿膜肽在兩種細胞中的綠色熒光亮度提高明顯，而在其他細胞中的綠色熒光亮度仍然很低;當腫瘤細胞濃度增大到20 μmol/L時，CPP33、CPP44兩種穿膜肽在A549、HepG2兩種細胞中的綠色熒光亮度有所增加，但增加幅度較10 μmol/L時有所減少，并且其他細胞中的綠色熒光亮度也有不同幅度提高. 如圖1所示.

2.1.2? ?不同濃度腫瘤細胞選擇性穿膜肽熒光細胞

計數

當腫瘤細胞濃度為2 μmol/L時，除A549細胞，CPP33在其余4種細胞中產生熒光的細胞數均低于5%;當腫瘤細胞濃度為5 μmol/L時，加有CPP33的細胞中，A549細胞中產生熒光的細胞數最高，大于20%;當腫瘤細胞濃度為10 μmol/L時，CPP33在A549細胞中產生熒光的細胞數大于50%;當腫瘤細胞濃度增大到20 μmol/L時，CPP33在A549細胞中產生熒光的細胞數約為60%. 如圖2（a）（b）（c）（d）所示. 當腫瘤細胞濃度為2 μmol/L時，CPP44在5種細胞中產生熒光的細胞數均不超過2.4%;當腫瘤細胞濃度為5 μmol/L時，加有CPP44的細胞中，HepG2細胞中產生熒光的細胞數最高，大于7.5%;當腫瘤細胞濃度為10 μmol/L時，CPP44在HepG2細胞中產生熒光的細胞數大于50%;當腫瘤細胞濃度增大到20 μmol/L時，CPP33、CPP44兩種穿膜肽在A549、HepG2兩種細胞中產生熒光的細胞數大于60%. 如圖2（e）（f）（g）（h）所示.

2.2? ?流式細胞儀檢測細胞熒光百分比

圖3為不同腫瘤細胞中波長超過102 nm的細胞數與細胞總數的百分比.在綠色熒光通道（FL1）中，流式分析10 μmol/L CPP33處理6 h后，5種細胞中A549細胞中含熒光細胞百分比最高，見圖3（b），大約分別是其他4種細胞（HeLa、MCF-7、U2OS、HepG2）熒光數目的兩倍，分別如圖3（a）（c）

（d）（e）所示. 同樣，流式分析10 μmol/L CPP44處理6 h后，5種細胞中HepG2細胞中含熒光細胞百分比最高，見圖3（j），大約分別是其他4種細胞（HeLa、A549、MCF-7、U2OS）熒光數目的兩倍，分別如圖3（f）（g）（h）（i）所示.

3? ?結? ?論

本實驗對兩種不同腫瘤細胞選擇性穿膜肽進行研究，運用不同細胞對比，發現CPP33穿膜肽能夠有效穿過肺癌細胞A549的細胞膜進入細胞. 同樣，CPP44穿膜肽能夠有效穿過肝癌細胞HepG2的細胞膜進入細胞.兩種穿膜肽均有較高腫瘤細胞選擇性.

細胞穿膜肽作為有效的藥物運輸載體已經在臨床有所運用，但由于細胞種類的多樣性和每種細胞的復雜性，目前針對特定細胞的選擇性穿膜肽只有少數被發現和應用，對于特殊細胞的穿膜肽的開發還處于初級階段.相對于非選擇性細胞穿膜肽，CPP33、CPP44具有良好的細胞選擇性，因此CPP33、CPP44可能成為有效的腫瘤選擇性藥物運輸載體，這也為實現腫瘤細胞的靶向治療提供了廣闊的前景.

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