USP18促進溶瘤病毒誘導的肝癌細胞凋亡機制

朱海珍 陳瑾文 許艷 薛斌斌 王鑫濤 鄧日林 田仁云 陳生穩 王靜靜 黃湘

摘? ?要：NDV感染肝癌細胞后，能夠誘導細胞的凋亡，在NDV感染肝癌細胞Huh7之后，能夠誘導一種去泛素化酶USP18的表達顯著上調. 為了探究USP18在NDV誘導的肝癌細胞的凋亡過程中起什么作用，以肝癌細胞系Huh7為實驗體系，以western blot蛋白免疫印跡和定量PCR為主要方法. 在細胞中過表達USP18，發現其能夠明顯促進肝癌細胞的凋亡，這表明USP18具有抗癌的功能.反之，敲低細胞中USP18的表達水平，能夠有效地抑制NDV誘導的肝癌細胞凋亡.進一步揭示了USP18促進NDV誘導的細胞凋亡的機制，USP18上調了定位于線粒體上的Bax的蛋白水平，Bax能與Bak在線粒體外膜上形成孔道，增加線粒體外膜的通透性，從而促進凋亡蛋白細胞色素C的釋放.同時，USP18還能誘導NOXA切割效應凋亡蛋白Caspase-7，進一步促進細胞凋亡.此外，USP18上調干擾素刺激基因ISG12a（IFN-stimulated gene 12a）的蛋白水平，抑制ISG12a的泛素化降解，這也是從另一個角度解釋了其促進凋亡作用.

關鍵詞：線粒體;肝癌細胞;USP18;NDV;細胞凋亡;Bax;NOXA;ISG12a

中圖分類號：Q71 ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A

USP18 Promotes Apoptosis of Liver Cancer Cells Induced by NDV

ZHU Haizhen1，2，3，CHEN Jinwen1，2，3，XU Yan1，2，3，XUE Binbin1，2，3，WANG Xintao1，2，3，

DENG Rilin1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，WANG Jingjing1，2，3，HUANG Xiang1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha? 410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha? 410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha? 410082，China）

Abstract：? After NDV infects the liver tumour cell，USP18 （Ubiquitin Specific Protease 18） acts as a deubiquitin enzyme and cleaves ubiquitin from ubiquitinated protein substrates. NDV infection of liver tumour cell can induce the apoptosis of cancer cells. Infection with NDV up-regulates the expression of USP18，and the role of USP18 in the apoptosis induced by NDV was investigated. In this study， the liver tumour cell line Huh7 is taken as the system， and western blot and qualitative PCR are considered. It is found that USP18 promotes the apoptosis of cancer cells induced by NDV，which demonstrates that USP18 has the anticancer function. In contrast， knock-down of USP18 inhibits the apoptosis of the cancer cells， which reveals that USP18 can positively regulate the protein level of Bax and NOXA. Consistently，overexpression of USP18 enhances the permeability of mitochondrial membrane and promotes the release of CYTOCHROME C. Similarly， overexpression of USP18 increases the cleaved caspase-7 and strengthens the apoptosis as well. It is also found that USP18 can upregulate the protein level of ISG12a（IFN-stimulated gene 12a）. It attenuates the ubiquitination degradation of ISG12a. The findings in this research provide a profound influence and a new insight towards treatment for liver cancer.

Key words： mitochondria;liver cancer cell;USP18;NDV;cell apoptosis;mitochondria;Bax;NOXA;ISG12a

細胞一旦生長增殖不受調控，就會不受約束的擴增，我們稱之為“脫韁之馬”. 無限增殖之后，將會形成腫瘤，腫瘤一旦惡化轉移，變為惡性腫瘤，我們稱之為“癌”. 肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是我國死亡率位居第二的惡性腫瘤.

目前，國內外許多學者都在孜孜不倦地研究抗癌治療手段，到現在為止，普遍的治療手段有手術切除、放射性治療、化學治療以及免疫治療等. 免疫治療是一個概念性的突破，開創了一個新的時代，著力于促進機體免疫功能正常化. 只要機體的免疫功能趨于正常化，能夠被調動，機體最終就能夠依靠自身的免疫功能清除腫瘤，殺死腫瘤，達到一個抗癌的效果.

肝癌是病死率最高的幾大惡性腫瘤之一[1]. 中國每年大約有38萬多人死于肝癌以及其連帶疾病，這給我們國家的人民和社會帶來了殘酷的挑戰和沉重的負擔. 而慢性肝臟炎癥的持續發展和惡性轉化便可導致肝細胞癌的發生. 肝炎可導致肝硬化、肝纖維化、肝癌等對國人的健康和社會經濟發展均帶來了強烈的沖擊和嚴峻的挑戰[2].

HBV慢性感染是我國HCC重要的成因. 我國臨床上90%以上的肝癌患者都攜帶HBV病毒. HBV一旦形成慢性感染，便很難從機體內徹底清除[3-5]. 因為HBV的核酸會在體內修復形成共價閉合環狀DNA，整合到宿主的細胞核內，定位于基因組中，跟隨宿主的遺傳物質一起復制，結構類似于質粒[6-7].

另外，除了HBV慢性感染以外，還有一類導致肝癌發生的疾病，那就是代謝性的肝病，代謝性肝病是一大類，包括肝-豆狀核變性、遺傳性血色病、抗胰蛋白酶缺乏、非酒精性脂肪肝、遺傳性酪氨酸血癥、糖原累積病和脂類累積病等[8-11].

然而調控肝癌細胞惡性程度，凋亡趨勢的分子主要有兩大類，一類是抑制肝癌細胞凋亡的基因，一般來說會促進腫瘤細胞的生長增殖;而另一類則是促進肝癌細胞凋亡的誘導基因，比如p53，細胞色素C等.細胞凋亡的一類核心成分是半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，細胞凋亡就是由蛋白酶的級聯放大切割過程所引發[12-15].

據文獻記載，一般比較公認的觀點是細胞凋亡途徑主要分為外源性途徑和內源性途徑.細胞外源性途徑當中，死亡受體和死亡配體相互結合，然后死亡受體被激活，它的死亡結構域再跟細胞內的一些信號轉導分子結合，傳遞死亡信號. 接下來轉導分子如FADD再與Caspase-8酶原的DED連接，這時能夠形成誘導死亡的一種復合物，這時Caspase-8被激活，活化的Caspase-8裂解BID，上調Bax和Bak，促進在線粒體上形成孔道，使線粒體膜的通透性增加，進而釋放凋亡蛋白細胞色素C，或者作用于下游的其他Caspase，活化的這些Caspase可以切割胞核內底物DNA修復酶PARP，導致cleaved PARP失去對DNA脫氧核糖核酸的修復功能，從而導致細胞走向凋亡[16]. 另外，細胞內源性途徑中，一些內源性的死亡信號，包括DNA損傷、有毒化學物質、Bax、原癌基因抑制劑、物理射線、能量通貨ATP耗竭等，這些細胞損傷死亡信號誘導線粒體釋放大量細胞色素C進入細胞質，之后激活APAF-1[17-20].接下來Cyt-C，APAF-1以及procaspase-9會形成一個所謂的凋亡小體.隨后經過Caspase家族的一個級聯放大反應，最終導致了細胞凋亡[17，21-23].

在本課題研究中，我們用NDV感染肝癌細胞Huh7，發現去泛素化酶USP18的表達顯著升高. 過表達USP18能夠促進NDV誘導的肝癌細胞凋亡. 反之，敲低USP18的表達可以抑制肝癌細胞的凋亡.所以接下來進一步探究其誘導凋亡的機制.我們發現，USP18的表達上調了Bax和NOXA，增加了線粒體膜的通透性，促進細胞色素C的釋放以及促進NOXA切割凋亡蛋白Caspase-7，進而促進細胞凋亡.此外，USP18還能上調ISG12a的蛋白水平，而ISG12a經過實驗研究發現，是能夠促進細胞凋亡的，這也就從另一個角度解釋了USP18能夠促進肝癌細胞凋亡的機制.

1? ?材料與方法

1.1? ?細胞系

Huh7 細胞是實驗室從American Type Culture Collection購買.

1.2? ?試? 劑

IFN-α（Roche），DMEM培養基和DMEM/F-12 培養基（Gibco），1×PBS（Hyclone），胰蛋白酶（Gibco），Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA），逆轉錄試劑盒（Takara），SYBR Green master 定量PCR試劑盒 （Roche），RIPA 裂解液（Thermo），蛋白酶抑制劑（Merck），USP18，PARP，Bax，細胞色素C，NOXA，Caspase-7，ISG12a等抗體（Cell Signaling Technology），β-actin抗體（Sigma）.

載玻片和蓋玻片（SPI Supplies），PVD膜（Bio-Rad），10 cm 細胞培養盤（Corning），60 mm 細胞培養板（Corning），6孔細胞培養板（Corning），1.5 mL離心管（Corning），200 μL RT-PCR八聯管（Axygen）.

1.3? ?儀器設備

-80 ℃超低溫冰箱（Thermo），-20 ℃冰箱（Haier），4 ℃冰箱（中科美菱），CO2恒溫細胞培養箱（Thermo），流式細胞儀（Beckman），超凈生物安全柜（AIRTECH），細胞計數儀（Beckman），液氮罐（Thermo），光學顯微鏡（OLYMPUS），紫外分光光度計（Bio-Rad），分析天平（上海天平儀器廠），超純水儀（Millipore），實時熒光定量PCR儀（Eppendorf），PCR儀（Eppendorf），低溫高速離心機（Eppendorf），凝膠成像系統（上海天能公司），化學發光成像系統（Bio-Rad）.

1.4? ?質粒構建

從Huh7細胞中提取總RNA，測得其RNA濃度后，將其逆轉錄為cDNA，然后以之為模板，PCR擴增USP18，瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR產物.PCR產物與載體p3×FLAG-CMV-vector 分別雙酶切，再次瓊脂糖凝膠電泳，回收純化，之后T4連接酶16 ℃連接過夜，第二天用感受態大腸桿菌轉化.挑單克隆菌落擴大培養，提取質粒. 質粒經過酶切鑒定，片段正確. 隨后質粒經過生工公司測序，返回序列. 經過DNAMAN比對，目的基因的序列與USP18吻合. 經過表達鑒定，質粒在Huh7細胞中表達.

構建USP18沉默質粒，首先在USP18開放閱讀框（ORF）中選取以AA開頭長度為21 nt的靶序列.然后依據靶序列設計長度為 63～64 nt 的 Top 鏈和 Bottom 鏈，這兩條引物鏈退火結合后連入 pRNAT-U6載體，得到 pRNAT-U6-USP18沉默質粒，測序鑒定插入序列正確.過表達質粒引物和沉默質粒靶序列分別如表1和表2所示.

1.5? ?蛋白免疫印記

利用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer裂解液裂解細胞并收集細胞總蛋白.根據試劑盒說明書方法用 BCA 堿性硫酸銅法測定蛋白質濃度. 蛋白樣品用2×Laemmli Sample Buffer進行稀釋，100 ℃加熱 5 min. SDS-PAGE凝膠電泳，采用PVDF膜轉膜，蛋白轉膜至PVDF膜上之后，以牛奶封閉1 h，再加入適當的一抗室溫孵育3 h或4 ℃過夜.二抗選用goat-anti-mouse或goat-anti-rabbit抗體室溫孵育3 h. 隨后將膜置于化學放光信號檢測儀（曝光機）上加入預先配制好的顯影液（Thermo）曝光適當的時間，得到顯影圖像.

1.6? ?實時熒光光定量PCR

用TRIzol reagent（Invitrogen，Carlsbad CA）提取細胞中的總RNA.隨后用逆轉錄試劑盒（Takara）將RNA逆轉錄為cDNA.接著用SYBR Green master（Roche）進行實時熒光光定量PCR.檢測USP18，ISG12a等基因的mRNA水平.

1.7? ?統計學分析

實驗數據導入Excel進行處理分析，對照和處理組之間的顯著性差異分析我們采用雙樣本等方差假設雙尾的 Student t-test .*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001指示顯著性差異程度，其中P小于0.05被認為存在統計學意義.

1.8? ?線粒體內細胞色素C的提取

6孔板收樣. 200 μL胰蛋白酶消化3 min ，之后加入1 mL 的PBS吹散.把樣品轉移至離心管內，離心，950 rcf（相對離心力），3 min. 加入150 μL的MIB（事先配置好），重懸.靜置于冰上，15 min. 用1 mL的注射器吹打30～50次，1 000 g，4 ℃離心10 min. 吸取上清于新的離心管中，進行二次離心. 最大轉速離心，10 min，4 ℃.再次吸取上清于新的離心管中，這就是胞漿中的蛋白. 沉淀為線粒體，這時可以加入RIPA buffer裂解，靜置幾分鐘，提取線粒體中的細胞色素C.

2? ?結? 果

2.1? ?NDV感染肝癌細胞誘導USP18的表達

Huh7細胞系是一種惡性肝臟腫瘤細胞，是由Kaneko等人[24]建立起來的，該細胞系源自一個日本男性高分化肝細胞肝癌.

NDV除了可以直接殺傷腫瘤細胞之外，還可通過改變腫瘤細胞的免疫原性，誘導機體的免疫系統產生多種細胞因子，來殺傷腫瘤細胞. 因此，它是一種有著很大發展前景的抗癌生物制劑. 我們發現，用NDV感染Huh7細胞后，在36 h的時候，USP18的mRNA水平有一個顯著地上調（圖1）. 然后同樣提取細胞總蛋白，經過蛋白免疫印跡方法檢測，我們發現在NDV感染36 h的時候，USP18的蛋白水平也有一個顯著地提高（圖2）.這些結果顯示，USP18在NDV感染肝癌細胞的過程中很可能有著某種作用，在感染36 h的時候，細胞進入一個凋亡階段，而恰恰在這個時候，USP18的表達水平顯著提高，這也就意味著USP18在細胞凋亡的過程中可能起著某種暫時未知的作用.接下來我們將繼續探討USP18究竟在細胞凋亡過程中起著什么樣的作用.

2.2? ?USP18促進NDV誘導的肝癌細胞凋亡以及其

機制研究

由前面研究可知，在NDV感染肝癌細胞Huh7之后，36 h的時候檢測到USP18在信使RNA水平和蛋白水平都有一個顯著地上調.所以，接下來我們就要一起來探討一下USP18在肝癌細胞凋亡過程中的功能.先構建了USP18的過表達質粒以及沉默質粒，并在Huh7細胞系當中，轉染構建好的過表達質粒以及沉默質粒，過表達質粒和沉默質粒均達到預期效果（圖3和圖4）. 然后，我們用該質粒進行后續實驗. 同樣，在Huh7細胞中，過表達USP18可以促進NDV所誘導的肝癌細胞凋亡（圖5，圖6）.

細胞內的DNA包括細胞核內染色質上的DNA以及胞漿內線粒體中的DNA，在細胞進入凋亡程序之后，染色質會發生濃縮，形成染色體，染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300 kb的DNA大片段，或是180～200 bp的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上表現為梯形的電泳圖（稱之為DNA ladder）. 細胞經過處理后，采用SV buffer試劑盒分離提純細胞的總DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，并用核酸染料溴化乙啶（EB）染色，在凋亡的細胞亞群中可觀察到典型的DNA ladder.

因此，我們在Huh7細胞中，過表達USP18之后用NDV感染細胞36 h，然后提取細胞中的總DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳. 電泳結果顯示，USP18促進細胞凋亡，增強了DNA ladder，增強了DNA的片段化（圖5），在Huh7細胞中過表達p3×flag-USP18-CMV，隨后感染NDV，在感染36 h的時候，提取細胞的總蛋白，對其進行蛋白免疫印跡分析，檢測到胞核內底物DNA修復酶PARP被切割的程度明顯增強，這意味著USP18顯著地促進了細胞的凋亡.

而與之相反，在Huh7細胞系中沉默USP18，在一定程度上反過來抑制了細胞的凋亡，跟之前的結果在邏輯上是一致的（圖7）.

細胞內的DNA，這包括細胞核內的染色質上的DNA以及胞漿內的線粒體中的DNA，在細胞進入凋亡程序之后，染色質會發生濃縮，形成染色體，染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300 kb的DNA大片段，或是180～200 bp的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上表現為梯形的電泳圖（稱之為DNA ladder）. 細胞經過處理后，采用SV buffer試劑盒分離提純細胞的總DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，并用核酸染料溴化乙啶（EB）染色，在凋亡的細胞亞群中可觀察到典型的DNA ladder.

因此，在Huh7細胞中過表達USP18之后用NDV感染細胞36 h，然后提取細胞中的總DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳. 電泳結果顯示，USP18促進細胞凋亡，增強了DNA ladder，增強了DNA的片段化（圖5）.

經過之前的研究，已經得出結論，USP18能夠促進NDV誘導的肝癌細胞凋亡. 那么，它是通過什么樣的方式促進這一過程的呢？我們知道凋亡蛋白Caspase-8被激活之后裂解Bid，從而使得線粒體膜的孔道增加，通透性增加，釋放細胞色素C，誘導細胞凋亡.隨后我們發現，過表達USP18能夠上調Bax的蛋白水平，同時也增強了細胞色素C的釋放. 此外，過表達USP18還能夠增強凋亡蛋白NOXA的表達，導致進一步地切割效應性的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase-7，增強細胞凋亡（圖6）.

與之相反，在Huh7細胞中沉默USP18，得到與之前相反的結果.沉默USP18后，下調了Bax的蛋白水平，也就減弱了線粒體外膜的通透性，抑制了細胞色素C的釋放.與此同時，沉默USP18能夠抑制凋亡蛋白NOXA的表達，也減弱了其對于Caspase-7的切割，抑制了下游凋亡信號的激活，抑制了細胞凋亡（圖7）.

實驗數據表明，USP18是通過影響了Bax以及NOXA，從而引起線粒體膜的通透性增加，釋放細胞色素C，并且通過NOXA切割Caspase-7，誘導下游的一系列級聯放大反應，最終促進肝癌細胞的凋亡.

2.3? ?USP18上調ISG12a的蛋白水平

ISG12a屬于一種干擾素刺激基因，具有激活機體免疫的功能. 本實驗室前期研究表明，ISG12a具有抗病毒功能，它能夠泛素化降解HCV的非結構蛋白NS5A，發揮它的抗病毒作用[25-31]. ISG12a同時還具有另外的功能，那就是可以殺傷腫瘤細胞.USP18在ISG12a的質譜圖中存在，所以猜測USP18是不是與ISG12a存在某種聯系.? 研究發現，在肝癌細胞系Huh7中，過表達USP18能夠上調ISG12a的蛋白水平（圖8），反之，沉默USP18，則相應地下調ISG12a的蛋白水平（圖9）.

因此，USP18能夠上調ISG12a的蛋白水平，從而促進細胞的凋亡. 那么，USP18作為一個去泛素化酶，它極有可能是通過去泛素化ISG12a，而抑制了ISG12a的泛素化-蛋白酶體途徑降解，最終達到其促進細胞凋亡的目的.我們做了相關的實驗，發現USP18能夠去泛素化ISG12a，這與我們的預期猜測是相吻合的（圖10）.

3? ?討? ?論

在NDV誘導的肝癌細胞凋亡中，有很多分子參與到了這個過程，這是一個十分復雜的調控過程.研究發現，ISG12a可以促進肝癌細胞的凋亡，而沉默了ISG12a之后的細胞卻生長得異常迅速. 于是，我們用ISG12a打質譜分析，從中找到了一種去泛素化酶USP18.經過檢測，在NDV感染肝癌細胞之后，USP18的表達量上調顯著，于是推測USP18在細胞凋亡過程中可能會起到某種作用.研究發現，USP18可以促進NDV誘導的細胞凋亡.換句話說，當NDV感染細胞后，可誘導產生促凋亡蛋白USP18，后者發揮著它的促凋亡功能. 進一步研究表明了USP18促進細胞凋亡的部分機制.一方面，它可以上調Bax，增加凋亡蛋白細胞色素C的釋放;另一方面，它還能夠上調NOXA，從而促進切割Caspase-7，共同促進細胞凋亡.另外，我們研究發現，USP18還能夠上調ISG12a的蛋白水平，抑制它的泛素化降解.這又從另一個方面解釋了USP18的促凋亡功能，它是通過上調了ISG12a，來進一步發揮它的抗癌功能[32-34]. 那么，USP18是如何上調ISG12a的蛋白水平的，又是如何上調Bax和NOXA的，這還有待接下來更加深入地研究，相信這將會是一個十分有意義的過程.我們的發現對于肝癌的防治有著積極的影響，并為臨床上的治療提供了新的理論依據和潛在的作用

靶點.

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