香丹注射液內毒素檢查法的可行性研究

王繼兵 陳 君

（1 湖北省襄陽市谷城縣廟灘中心衛生院，湖北 襄陽 441721；2 湖北省襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021）

香丹注射液收錄在衛生部藥品標準中藥成方制劑十七冊，是由丹參和降香2味中草藥制成，為棕色的澄明液體。有擴張血管，冠狀動脈血流量的功效，臨床靜脈滴注用于心絞痛，亦可用于心肌梗死。由于其療效顯著，價格低廉，在臨床上使用非常普遍。目前該藥仍沿用家兔法檢測熱原，家兔法操作繁瑣、費時、成本高，靈敏度低，我們現根據2015年版藥典四部細菌內毒素檢查法和熱原家兔法的要求[1]，對該藥進行了檢測研究對比，結果表明，香丹注射液可以用細菌內毒素檢查法代替家兔法檢測熱原，但是應考慮到藥物對試驗的干擾。

1 儀器與材料

1.1 儀器：旋渦式混懸器（天津藥典標準儀器廠，ZH-2型）；電熱恒溫水浴箱（江蘇金壇市中大儀器廠，420型）；無熱源移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 材料：鱟試劑2個規格，各2批（湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.5 Eu/mL，批號1504152，批號1608291，靈敏度0.25 Eu/mL，批號1612091，批號1703151），細菌內毒素檢測用水（湛江安度斯生物有限公司，規格5.0 mL，批號1506080），細菌內毒素工作標準品（湛江安度斯生物有限公司，規格10EU/支，批號1507080）。熱原用家兔，健康并經預測合格，香丹注射液（國藥集團宜賓制藥有限責任公司，批號17070214、17090314）

2 結 果

2.1 內毒素限值的確定：按中國藥典2015年版4部1143規定，藥品、生物制品細菌內毒素限值（L）按以下公式確定：L=K/M，K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素計量，注射劑K=5EU/（kg·h），M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，香丹注射液的用法用量中一次最大注射量為20 mL，藥典規定人均體質量按60 kg計算，注射時間按1 h計算，則M=20 mL/（60 kg×1 h）=0.334mL/（kg·h），以此計算出香丹注射液內毒素的限值（L）=5EU/（kg·h）/0.334mL/（kg·h）=15EU/mL。

2.2 確定最大有效稀釋倍數MVD：藥典規定MVD=cL/λ，其中c為供試品溶液的濃度，這里依據藥典，c=1.0 mL/mL，在上一部分我們已經根據香丹注射液的使用說明和藥典規定計算出L=15 EU/mL，我們常用的鱟試劑靈敏度為0.5 EU/mL，計算出MVD=cl/λ=30。

2.3 鱟試劑靈敏度復核試驗：2015年版藥典規定，當使用了新批號的鱟試劑或實驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。將10EU/支的細菌內毒素國家標準品用細菌內毒素檢測用水1.0 mL溶解并在旋渦混合器上混勻15 min后，依法制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ4個濃度的內毒素標準溶液，稀釋方法按照如下公式：

每個濃度平行做4支管，再加上兩支陰性對照管，每個批次鱟試劑一共18支管，按2015版藥典四部操作。經復核，本次試驗所用四個批次鱟試劑最大濃度2λ的四支管均為陽性，最小濃度0.25λ的四支管均為陰性，陰性對照管均為陰性，本次實驗結果有效，且四個批次鱟試劑λc計算結果均在2λ-0.25λ之間，可用標示靈敏度0.5 EU/mL（0.25 EU/mL）為該批次鱟試劑的靈敏度。

2.4 干擾試驗

2.4.1 預實驗：將供試品溶液按梯度稀釋最大至30倍的5個稀釋級的溶液，用標示濃度為0.5 EU/mL的鱟試劑按中國藥典2015年版四部1143鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，每個濃度平行做4支管，另加2支陰性對照管和2支供試品陰性對照管，2個批次供試品結果相同。標示靈敏度0.5EU/mL批號1504152和批號1608291的鱟試劑結果相同，見表1。

從表1可以看出，本次實驗有效，但是該供試品在稀釋到30倍時，對含1λ內毒素的鱟試劑有干擾導致結果為陰性，按藥典規定，此時可通過對供試品進行更大倍數的稀釋來排除干擾，我們只有將其繼續往下稀釋，此時MVD改變，c和L不變，故λ應為0.25 EU/mL，改用標示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，稀釋至最大為60倍的6個稀釋級繼續重復上述預干擾試驗，標示靈敏度為0.25 EU/mL批號1612091和批號1703151的鱟試劑實驗結果相同，見表2。

稀釋到60倍時，陰性對照管所有平行管都為陰性，2λ管均為陽性，0.25λ管均為陰性，試驗有效，1λ管均為陽性，干擾被排除。由此可以得出香丹注射液對內毒素檢查法有干擾，稀釋60倍可去除干擾。

2.4.2 干擾試驗：按照中國藥典2015年版四部1143細菌內毒素檢查法項下干擾試驗表1制備溶液A、B、C、D，試驗方法和步驟按按鱟試劑靈敏度復核試驗項下[4]。其中供試品溶液為稀釋60倍的溶液。見表3。

表3中A和D都為陰性：鱟試劑靈敏度復核結果符合要求：供試品60倍稀釋液實驗結果復核靈敏度復核實驗要求。供試品干擾試驗通過。

表2 標示靈敏度為0.25 EU/mL批號1612091和批號1703151的鱟試劑實驗結果相同比較

表3 凝膠法干擾試驗

2.5 家兔法檢測：按中國藥典2015年版一部1142熱原檢查法檢驗，注射劑量按標準規定為0.5 mL/kg，2批次供試品實驗結果如下：第一批次：批號17070214：選取健康并經預測合格試驗用家兔3只，體質量分別為2.1 kg、2.2 kg、2.3 kg，注射劑量12.0 mL、11.0 mL、11.5 mL。自兔耳靜脈緩緩注射，三只家兔體溫升高分別為0.3 ℃、0.4 ℃、0.1 ℃，體溫升高總和0.8 ℃。結果符合規定。第二批次：批號17090314：同法操作，三只家兔體溫升高分別為0.2 ℃、0.1 ℃、0.0 ℃，體溫升高總和0.3 ℃。結果符合規定。本次實驗2批次供試品熱原試驗符合規定。

2.5 供試品用細菌內毒素檢查法與家兔法檢測結果比較：本次實驗2批次供試品稀釋60倍，參照2015年版藥典四部1143細菌內毒素檢查法，用0.25EU/支的鱟試劑檢驗，結果均為陰性。按照2015年版藥典四部1142熱原檢查法進行檢測，結果也均符合規定，兩種方法結果完全一致。

3 討 論

香丹注射液為中成藥制劑，為臨床常用藥品，目前仍采用家兔法檢測熱原，費時費力，且成本高。大家都在檢討對它改成進行細菌內毒素檢查法，但是在實驗中應考慮到藥品本身對試劑的干擾，經論證，實驗中應用0.25 EU/mL的鱟試劑檢驗的采用供試品60倍稀釋液對樣品進行檢測以去除干擾。