吉西他濱對人舌鱗癌Tca8113細胞的放射增敏作用及其機制研究*

劉星驗，張斌，馬竟，陳健

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院 口腔頜面外科，遼寧 錦州 121000；2.葫蘆島市第二 人民醫院，遼寧 葫蘆島 125000）

舌癌是最常見的口腔癌[1]，有較強的局部浸潤性和轉移率高等特點，可導致咀嚼、言語和吞咽等功能失常，甚至有死亡的風險。舌癌對放射的敏感性不高，臨床上主要是手術治療，積極探討放療增敏的新方法成為研究熱點之一[2]。吉西他濱（Gemcitabine, GEM）是脫氧胞苷的水溶性類似物[3]，具有放射增敏作用強，毒副作用較小的特點[4]。本研究以GEM聯合放療作用于舌鱗癌Tca8113細胞，研究其對Tca8113細胞放射敏感性的影響及可能的作用機制，為舌癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞舌鱗癌Tca8113細胞購于中國科學院上海細胞生物研究所。

1.1.2 試劑GEM購于美國ApexBio公司，DMEM培養基、胰蛋白酶購于美國HyClone公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）購于北京索萊寶科技有限公司，鏈霉素/青霉素（雙抗）、四甲基偶氮唑藍（ttihiazoly blue, MTT）購于上海碧云天生物技術有限公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，流式細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養Tca8113細胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中培養，置于37.0℃、5%二氧化碳CO2恒溫細胞培養箱中，定期傳代、換液，取對數期Tca8113細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法測定取對數生長期的Tca8113細胞，消化、重懸、計數后置于96孔板內，5×103個/孔細胞，每組設3個復孔，測量重復3次。細胞貼壁后，加入不同濃度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）完全培養基培養24 h后終止培養，每孔加入質量濃度為5 mg/ml的MTT 20μl，37℃條件下孵育4 h。棄上清液，每孔加入150μl DMSO。搖床上震蕩10 min，使用多功能酶標儀在490 nm波長處測定光密度（optical density, OD）值。以OD值顯示實驗結果，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。據此計算出GEM對Tca8113細胞增殖的影響，選定最佳濃度進行后續 實驗。

取Tca8113細胞接種于96孔板內，每孔細胞數為5×103個，將其分為空白對照組、GEM組（0.02μmol/L）、單純放療組（4 Gy）、GEM（0.02μmol/L）聯合放療組（4 Gy）。處理24 h，用MTT法明確最佳照射劑量。

1.2.3 平板克隆實驗將1×103個Tca8113細胞接種在6孔板中，待細胞貼壁后棄培養液分為空白對照組、GEM組、單純放療組、GEM聯合放療組。加入GEM處理細胞24 h，暴露于4 Gy照射，繼續在孵箱中孵育10～14 d，棄培養液，洗滌、固定及染色后，計數各孔集落數（≥50個細胞為1個集落）。計算各組細胞克隆率。

1.2.4 流式細胞術將Tca8113細胞用0.02μmol/L GEM處理24 h后，4 Gy照射或不予處理，與空白對照組比較。5 min離心1 500 r/min收集懸浮細胞。貼壁細胞用胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液漂洗細胞2次，并進行細胞計數、離心，收集1×105～3×105個細胞，將收集的細胞重懸于150μl染色溶液中，加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入10μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應5～15 min。應用流式細胞儀測量細胞凋亡率。

1.2.5 Western blotting0.02μmol/L GEM處理Tca8113細胞24 h后，吸出培養液，放療繼續作用細胞24 h，Western blotting檢測各組Tca8113細胞中Bax、Bcl-2、 Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達水平。收集空白對照組、GEM組、單純放療組和GEM聯合放療組的細胞，胰酶消化后將收集的細胞離心并重懸于裂解緩沖液中。冰上孵育30 min后，提取澄清勻漿4℃、12 000 r/min離心20 min。BCA蛋白定量試劑盒檢測各組蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠中的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，300 mA濕轉90 min，室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應稀釋比例的一抗孵育過夜，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，化學發光法顯影、定影后掃描分析。采用Image J圖像分析軟件分析灰度值，計算出樣本蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT測定結果

2.1.1 GEM對Tca8113細胞活力的抑制作用不同濃度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）作用時細胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（98.59±0.20）%、（95.46±0.08）%、（94.79±0.08）%、（93.95±0.24）%、（91.77±0.54）%及（73.90±2.98）%，經方差分析，差異有統計學意義（F =171.025，P =0.000）；與0.000μmol/L組比較，GEM濃度為0.010、0.020、0.030、0.100、1.000μmol/L時細胞存活率降低（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 Tca8113細胞在不同濃度時的細胞存活率曲線

2.1.2 GEM對放療的增敏作用空白對照組、GEM組、單純放療組和GEM聯合放療組細胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（84.83±1.78）%、（80.64±1.44）%和（73.95±1.24）%，經方差分析，差異有統計學意義（F =214.368，P =0.000）；與空白對照組比較，其他各組細胞存活率降低（P ＜0.05）；與單純放療組比較，GEM聯合放療組細胞存活率降低（P ＜0.05）。見 圖2。

圖2 各組Tca8113細胞存活率比較 （±s）

2.2 GEM聯合放療對Tca8113細胞集落形成的影響

放射劑量選定4 Gy，空白對照組、GEM組、單純放療組和GEM聯合放療組克隆形成率分別為（33.83±1.15）%、（28.46±1.42）%、（15.50±1.10）%和（0.00±.00）%，經方差分析，差異有統計學意義（F =593.548，P =0.000）；與單純放療組比較，GEM聯合放療組克隆形成率降低（P ＜0.05），幾乎處于靜止期。見圖3。

2.3 GEM增強射線誘導細胞的凋亡

流式細胞術檢測發現，空白對照組、GEM組、單純放療組和GEM聯合放療組細胞凋亡率分別為（0.03±0.01）%、（5.68±0.18）%、（6.54±0.23）%和（28.63±0.38）%，經方差分析，差異有統計學意義（F =7959.927，P =0.000）。與空白對照組比較，GEM組和單純放療組的Tca8113細胞發生凋亡（P ＜0.05）；兩者聯用后較單純放療組凋亡率升高（P ＜0.05），說明GEM能增強放療對Tca8113細胞的敏感性。見圖4。

2.4 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平

圖3 各組Tca8113細胞克隆實驗細胞集落形成圖

圖4 GEM聯合放療對Tca8113細胞凋亡的影響

各組細胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與空白對照組比較，GEM組、單純放療組和GEM聯合放療組中Bcl-2蛋白相對表達量降低（P ＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對表達量升高（P ＜0.05）；GEM聯合放療組中Bcl-2蛋白相對表達量較單純放療組和GEM組降低（P ＜0.05）；GEM聯合放療組中Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對表達量較單純放療組和GEM組升高（P ＜0.05）。線粒體凋亡途徑相關蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達增強或減弱可能是GEM提高放療誘導舌鱗癌Tca8113細胞凋亡作用的機制之一。見表1和圖5。

表1 各組細胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達水平比較 （±s）

表1 各組細胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達水平比較 （±s）

組別Bcl-2BaxCleaved Caspase-3Cleaved Caspase-9空白對照組0.949±0.0020.347±0.0370.597±0.0150.040±0.007 GEM組0.904±0.0000.591±0.0111.113±0.0740.125±0.005單純放療組0.883±0.0030.802±0.0071.519±0.0300.147±0.006 GEM聯合放療組0.787±0.0040.892±0.0042.060±0.0530.523±0.014 F值1 549.012437.764479.0141 651.308 P值0.0000.0000.0000.000

圖5 Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達的變化

3 討論

舌癌是惡性程度極高的口腔癌，放療是提高生存率的重要治療手段之一。既往研究發現，GEM能提高乏氧細胞對放射線的敏感性，抑制DNA合成，從而達到抗腫瘤作用[5]。本實驗旨在研究GEM聯合放療時，提高對Tca8113細胞增殖的抑制、凋亡的能力，從而起到放療增敏作用的機制。

有研究表明，GEM對胰腺癌細胞的增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性[6]。本實驗得出相類似的結果，在此基礎上將放療與GEM聯合作用于Tca8113細胞，發現GEM聯合放療組比單純放療組細胞存活率低。克隆形成實驗和流式細胞術的結果說明，GEM對Tca8113細胞具有放射增敏作用。

線粒體介導的內源性途徑為細胞凋亡早期的重要途徑[7-8]。本實驗選取線粒體途徑相關蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9作為監測指標，進一步探究GEM增強Tca8113細胞的放射敏感性。在線粒體介導的凋亡途徑中[9]，Bax為線粒體上的一種跨膜因子，在凋亡信號的誘導下，Bax轉移到線粒體外膜處，促進線粒體膜通透性的改變，釋放的細胞色素C能與Caspase-9形成凋亡小體，Caspase-9自我活化后再激活Caspase-3，從而促進細胞凋亡。LI等[10]發現，GEM作用于人胰腺癌CFPAC-1細胞系后，抑制Bcl-2蛋白的表達，即Bax/Bcl-2比率升高，兩者形成同二聚體，降低線粒體跨膜電位。隨著Ca2+濃度升高，激活啟動因子Caspase-9，進一步誘導“死亡蛋白酶”、Caspase-3，進而引起細胞走向凋亡。研究表明，經GEM聯合放療處理的胰腺癌BXPC-3細胞出現Bax基因表達升高，Bcl-2基因表達降低，這些細胞表現出更高的放射敏感性[11]。本實驗研究GEM聯合放療作用于舌鱗癌Tca8113細胞得出類似結果，與單純放療組比較，GEM聯合放療組可通過誘導舌癌Tca8113細胞中Bcl-2蛋白，使Bcl-2蛋白表達水平下降，Bax蛋白表達則升高。Caspase-3是Caspase級聯反應中發揮凋亡作用的執行者，Caspase-3通常以酶原的形式存在，活化后形成C1eaved Caspase-3發揮凋亡作用[12]。本實驗中，GEM聯合放療組中C1eaved Caspase-9、C1eaved Caspase-3蛋白表達比單純放療組更顯著，與Bcl-2表達變化相反。筆者推測，GEM聯合放療可以通過線粒體介導內源性途徑誘導Tca8113細胞的凋亡，增加放射敏感性，這與WOUTERS等[13]研究結果一致。

綜上所述，GEM具有增強放療誘導Tca8113細胞凋亡的能力，可提高舌癌的放射敏感性。其主要機制可能是促進Bax基因的表達，抑制Bcl-2進而激活Caspase-9，活化Caspase-3，下游底物剪切被激活，進而誘導細胞凋亡。