高海拔地區藏族和漢族乳腺浸潤性導管癌凋亡相關蛋白及凋亡指數的研究*

楊娟，李亞飛，宋曉燕，袁青玲，祁玉娟

（青海省人民醫院，青海 西寧 810007）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發病率逐年上升[1]，其在不同地域、種族和民族間存在差異[2]。腫瘤大小、淋巴結陽性率、激素受體、HER-2及Ki-67指數是乳腺癌預后因素[3]。Bcl-2作為一種凋亡抑制基因，對乳腺癌的預后及轉移具有預測作用[3-4]。本研究通過免疫組織化學法研究世居青海的藏族和漢族乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax、Caspase-3及凋亡指數（apoptosis index, AI）的表達，探究高海拔地區藏族與漢族乳腺癌生物學行為的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月—2015年12月在青海省人民醫院接受手術治療的藏族和漢族乳腺浸潤性導管癌患者各60例。臨床分期按美國癌癥聯合會第7版臨床分期[5]。以Bloom-Richardson系統方案對乳腺癌組織學進行分級[6]。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

Bcl-2鼠抗人單克隆抗體（丹麥DAKO公司），Caspase-3、Bax 兔抗人單克隆抗體（北京中山生物技術有限公司），免疫組織化學實驗采用丹麥DAKO公司ChemMate EnVision檢測系統K500711檢測試劑盒，原位DNA缺口末端標記（terminal deoxynucleotidy transferase-mediated digoxigenin-11-dUTP nick end labeling, TUNEL）選用瑞士羅氏公司診斷試 劑盒。

1.3 方法

1.3.1 標本收集及處理手術切除的新鮮乳腺浸潤性導管癌標本，取組織中心部分，10%中性甲醛溶液固定，分別用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色、免疫組織化學染色及AI研究。

1.3.2 HE染色將已固定的組織標本經梯度脫水、浸蠟及包埋后，以4μm厚度為標準進行連續切片，常規HE染色。

1.3.3 免疫組織化學染色檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達高壓處理組織切片后，修復暴露抗原。設置陽性和陰性對照，陽性對照為已知陽性切片，空白對照用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗，嚴格遵守試劑盒說明書操作。DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水、透明，中性樹脂封片，顯微鏡 觀察。

1.3.4 TUNEL檢測AI嚴格遵守TUNEL試劑盒說明書進行制作石蠟切片，脫蠟、水化后細胞通透，加入TUNEL反應液加入Converter-POD，與底物DAB反應顯色，光學顯微鏡計數并拍照，分析結果；實驗同時設置陽性及陰性對照。

1.4 結果判定

染色陰性：無目標細胞染色；染色陽性：弱陽性（+）（1%～25%）；陽性（++）（26%～50%）；強陽性（+++）（51%～75%）；強陽性（++++）（＞75%）。染色強度：弱染色：細胞染色在40物鏡視野才能看到；強染色：細胞染色在4倍或10倍物鏡視野能看到；中等染色：介于強染色與弱染色之間。細胞凋亡陽性判斷：光學顯微鏡觀察腫瘤細胞核，細胞核棕黃色為陽性細胞，呈均勻染色或顆粒狀。AI：陽性細胞在腫瘤中所占的百 分比。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的染色情況

Bcl-2染色陽性主要表達于細胞核和細胞漿，Caspase-3和Bax染色陽性主要表達于細胞漿和細胞核。見圖1。

2.2 TUNEL的染色情況

以光學顯微鏡或電子顯微鏡對原位凋亡細胞的觀察為金標準。細胞凋亡在形態學上可表現為細胞核崩解、核膜消失、染色質凝聚、凋亡小體形成、細胞皺縮及碎裂等。見圖2。

2.3 藏族、漢族乳腺浸潤性導管癌患者臨床資料比較

高海拔地區藏族、漢族乳腺浸潤性導管癌患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、淋巴結是否轉移、雌激素陰性與陽性受體、孕激素陰性與陽性受體、Ki-67不同比例及Her-2陰性與陽性等構成比比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見 表1。

圖1 乳腺浸潤性導管癌中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達 （免疫組織化學染色）

圖2 乳腺浸潤性導管癌細胞形態 （TUNEL染色）

表1 高海拔地區藏族、漢族乳腺浸潤性導管癌患者臨床資料比較 （n =60，例）

2.4 不同臨床病理特征乳腺浸潤性導管癌患者的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達

120例乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達率分別為45.0%（54/120）、69.2%（83/120）和59.2%（71/120）。乳腺浸潤性導管癌Bcl-2陽性患者淋巴結是否結轉移、雌激素受體陰性與陽性及孕激素受體陰性與陽性等構成比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。乳腺浸潤性導管癌Caspase-3陽性患者雌激素受體陰性與陽性構成比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。120例乳腺浸潤性導管癌患者其他臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見 表2。

表2 不同臨床病理特征乳腺浸潤性導管癌患者的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達比較 例（%）

2.5 高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者不同臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達

高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌Bcl-2陽性患者淋巴結是否轉移及雌激素受體陰性與陽性等構成比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌Caspase-3陽性患者雌激素受體陰性與陽性構成比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者其他臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表3。

2.6 高海拔地區藏族、漢族乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達

高海拔地區藏族、漢族乳腺浸潤性導管癌患者Bcl-2、Bax及Caspase-3陽性表達比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表4。

表3 藏族乳腺浸潤性導管癌患者不同臨床病理特征的Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達情況比較 例（%）

表4 高海拔地區不同民族乳腺浸潤性導管癌中Bcl-2、Bax及Caspase-3的陽性表達比較 [n =60，例（%）]

2.7 高海拔地區乳腺浸潤性導管癌Bcl-2、Bax及Caspase-3的比較

高海拔地區浸潤性乳腺癌Bcl-2陽性與陰性患者的Caspase-3表達比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。藏族乳腺浸潤性導管癌Bcl-2陽性與陰性患者的Bax、Caspase-3表達比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表5、6。

2.8 高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者AI與臨床病理特征的關系

高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者AI陽性與陰性構成比分別為37/23和36/24，經χ2檢驗，差異無統計學意義（χ2=0.035，P =0.852）。

高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者AI陽性與陰性患者腫瘤大小、臨床分期及孕激素受體陰性與陽性等構成比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）；但年齡、組織學分級、淋巴結是否轉移、雌激素受體陰性與陽性、Ki-67不同比例及Her-2陰性與陽性等構成比比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表7。

表5 高海拔地區乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2表達與Bax、Caspase-3表達的關系 例

表6 高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌組織中Bcl-2表達與Bax、Caspase-3表達的關系 例

表7 高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌患者AI與臨床病理特征的關系 例（%）

3 討論

乳腺癌的發生、發展與多個癌基因和抑癌基因的失活及細胞增殖與凋亡的失衡有關。高海拔地區獨特的高寒、缺氧環境，是該地區藏族乳腺癌的高發病率及高病死率的重要原因。不同民族間凋亡相關蛋白的表達差異的研究相對較少。

Bcl-2在調控細胞凋亡方面起重要作用[7]，其表達程度與p53的表達呈負相關，并且與乳腺癌預后呈正相關[8]。體外實驗的不同細胞模型中Bcl-2的高表達導致生長抑制，這與Bcl-2抑制細胞凋亡，還與延長細胞周期有關[9]。有研究表明，腋窩淋巴結陽性乳腺癌患者中，Bcl-2的高表達水平對總生存的延長有獨立的預測作用[10]。楊黎等[11]研究認為，Bcl-2可用于判斷乳腺癌生存預后，并與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結轉移等臨床病理因素無關。本研究提示，Bcl-2表達與雌激素受體、孕激素受體表達及淋巴結轉移相關，而與年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、Ki-67及Her-2表達無關。也有研究表明，Bcl-2表達受雌激素調節。Bcl-2在雌激素受體、孕激素受體陽性乳腺癌中高表達[12-13]，這與本研究的結果一致，提示Bcl-2高表達乳腺癌患者采用內分泌治療效果會更好。

Bax是誘導凋亡基因，其和Bcl-2共同平衡細胞的生存與凋亡。既往研究表明，Bax表達與腫瘤大小相關，＞5 cm的乳腺腫瘤中Bax表達更高[14]。SHARIFI等[15]研究認為，Bcl-2/Bax比例影響紫杉醇在乳腺癌化療中的療效。楊黎等[11]研究表明，Bax表達與淋巴結轉移及腫瘤分期晚有關，并認為Bax與不良的生物學特性相關。本研究結果提示，Bax表達與年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移、雌激素受體、孕激素受體、Ki-67及Her-2表達無關，這可能是由于本研究相關較小的樣本量導致，在今后的研究中會考慮擴大樣本量來進一步觀察結果。

Caspase-3是細胞凋亡的效應器。黑靜雅等[16]研究認為，Caspase-3是凋亡的核心蛋白酶，其表達下調和缺失與惡性腫瘤逃避細胞凋亡的自我調節相關。本研究結果提示，高海拔地區乳腺癌Caspase-3的表達與組織學分級、淋巴結轉移及雌激素受體表達相關。Caspase-3是乳腺癌臨床評價腫瘤生物學及判斷預后的參考指標。腫瘤組織AI對腫瘤的發生、發展及預后具有重要作用[17]。本研究結果認為，高海拔地區藏族乳腺浸潤性導管癌AI與腫瘤大小、臨床分期、孕激素受體表達相關，且AI的表達與民族無關。

綜上所述，凋亡相關蛋白的表達對乳腺浸潤性導管癌的治療及預后具有一定的提示作用。中國漢族乳腺癌的研究較多，而少數民族乳腺癌的研究報道相對較少。本研究的結果對高海拔地區的乳腺浸潤性導管患者個體化治療方案的制定，以及預后判斷具有提示作用。