甲殼質(zhì)酶蛋白40對腎結(jié)核的診斷效能及關(guān)系研究

陳懷安，劉碩，李秀君，王哲，張潮，李鳳岐，苗文隆

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，河北 張家口 075000）

泌尿結(jié)核是最常見的肺外結(jié)核，近年來隨著耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，其發(fā)生率呈上升趨勢，其中腎結(jié)核最為常見且最早發(fā)生。1989年，HANCE將尿聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核桿菌檢測，但由于技術(shù)原因存在局限性，易導(dǎo)致DNA污染致假陽性，而且若結(jié)核菌未排入尿中，必然導(dǎo)致假陰性[1-3]。本文探討甲殼質(zhì)酶蛋白40（YKL-40）水平與腎結(jié)核的關(guān)系，分析YKL-40對腎結(jié)核的診斷效能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年8月—2017年8月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的46例腎結(jié)核患者作為研究組，另選取同期來院體檢的46例健康志愿者作為對照組。研究組：男性29例，女性17例；年齡31～76歲，平均（52.2±4.5）歲。對照組：男性30例，女性16例；年齡30～78歲，平均（52.5±4.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)檢查和診斷符合腎結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]并經(jīng)病理診斷核實；②自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他結(jié)核疾??；②合并其他對研究有影響的嚴(yán)重疾病。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 YKL-40檢測所有研究對象晨起抽取空腹靜脈血3 ml，3 000 r/min離心15 min收集上層血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測研究對象血清YKL-40水平，試劑盒由美國Quidel公司提供，檢測過程中嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）①儀器和試劑：采用由德國Gene公司生產(chǎn)的Rotorgene 3000 qRT-PCR儀進(jìn)行檢測，DNA提取試劑盒由美國Sigma公司生產(chǎn)，德國Gene公司提供SYBR實時定量試劑。以β-actin為內(nèi)參，以特異性結(jié)合分支桿菌插入序列IS6110為目的基因。β-actin正向引物：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'；反向引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。結(jié)核桿菌正向引物：5'-TTGGAAAGGATGGGGTCA-3'；反向引物：5'-CGCAGCCAACACCAAGTAG-3'。所有引物由日本TaKaRa公司設(shè)計合成。②檢測方法：按試劑盒操作說明書進(jìn)行DNA提取及標(biāo)準(zhǔn)品制備。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40個循環(huán)。所得結(jié)果以陰陽性表示。陽性：Ct值≤35。每個標(biāo)準(zhǔn)點進(jìn)行3次重復(fù)測量，取平均值，每次實驗設(shè)立空白對照組。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組血清YKL-40水平，觀察腎結(jié)核患者病變組織和周圍健康組織YKL-40表達(dá)水平。對比PCR檢測方法，分析YKL-40水平檢測對腎結(jié)核患者的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC曲線。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清YKL-40表達(dá)水平比較

研究組與對照組血清YKL-40水平分別為（29.36±6.52）和（20.06±5.91）ng/ml，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =7.168，P =0.000），研究組血清YKL-40水平高于對照組。

2.2 病變組織與周圍健康組織YKL-40表達(dá)水平比較

腎結(jié)核病變組織與周圍健康組織YKL-40表達(dá)水平分別為（31.52±6.87）和（26.15±5.59）ng/ml， 經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =4.112，P =0.000），病變組織YKL-40水平高于周圍健康組織。

2.3 YKL-40與qRT-PCR檢出腎結(jié)核陽性率 比較

YKL-40與qRT-PCR檢出腎結(jié)核陽性率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.817，P =0.000），YKL-40檢出腎結(jié)核陽性率高于PCR。見表1。

表1 YKL-40與qRT-PCR檢出腎結(jié)核陽性率比較

2.4 YKL-40、qRT-PCR對腎結(jié)核的診斷效能

YKL-40 ROC曲線下面積為0.930（95% CI： 0.900，0.969），敏感性為76.09%（35/46），特異性為91.30%（42/46），陽性預(yù)測值為50.85%（30/59），陰性預(yù)測值為96.97%（32/33）。qRT-PCR ROC曲線下面積為0.790（95% CI：0.736，0.849），敏感性為82.61%（38/46），特異性為63.04%（29/46），陽性預(yù)測值為20.00%（11/55），陰性預(yù)測值為97.30%（36/37）。YKL-40與qRT-PCR ROC曲線下面積比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.348，P =0.000）；YKL-40 ROC曲線下面積大于PCR。見圖1、2。

圖1 YKL-40的ROC曲線

圖2 qRT-PCR的ROC曲線

3 討論

我國結(jié)核病人數(shù)居全球第2位，是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的國家之一，尤其高發(fā)于偏遠(yuǎn)農(nóng)村山區(qū)。泌尿系結(jié)核在張家口偏遠(yuǎn)農(nóng)村山區(qū)易發(fā)、高發(fā)，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院每年收治上百例泌尿系結(jié)核患者，其中以腎結(jié)核最多見。臨床發(fā)現(xiàn)腎結(jié)核均有影像學(xué)表現(xiàn)或臨床癥狀，單純藥物治療已無法治愈，需手術(shù)切除單側(cè)腎臟才能治愈腎結(jié)核。所以，如何早期發(fā)現(xiàn)腎結(jié)核，早期藥物治療保留患者腎臟變得尤為重要。

YKL-40又名人類軟骨糖蛋白39或者殼多糖酶-3樣蛋白-1，屬于哺乳動物殼多糖酶樣蛋白家族[5]。 YKL-40蛋白最初是由REJMAN等[6]于1988年從非分泌期牛乳腺分泌物的乳清蛋白中分離發(fā)現(xiàn)，并于1992年由JOHANSEN等[7]鑒定和命名。1993年，HAKALA等[8]測出其完整的氨基酸及cDNA序列，結(jié)果顯示YKL-40是由383個氨基酸組成的單鏈多肽，N末端3個氨基酸為酪氨酸（Y）、賴氨酸（K）和亮氨酸（L），分子量為40 kD，所以稱其為YKL-40。YKL-40從不同類型的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、間皮細(xì)胞、滑液成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞釋放[9]。YKL-40水平在炎癥過程中升高，可能在炎癥相關(guān)細(xì)胞的趨化、蓄積和激活中發(fā)揮重要作用。YKL-40通過細(xì)胞膜激活細(xì)胞內(nèi)途徑，發(fā)揮幾丁質(zhì)傳感器樣作用，趨化巨噬細(xì)胞并激活感染的抗炎反應(yīng)[10]。有多項研究分析肺結(jié)核、肺癌及其他原因?qū)е滦厍环e液以及血清中YKL-40的濃度，結(jié)果不太一致，但總體發(fā)現(xiàn)胸腔積液中高濃度YKL-40有可能區(qū)分滲出液與漏出液，YKL-40胸腔積液/血清濃度之比有可能區(qū)分結(jié)核性與其他非結(jié)核性胸腔積液，證明YKL-40對局部炎癥有提示性診斷價值[11]。

關(guān)于腎病，目前只在腎移植后患者中分析YKL-40與腎損傷的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)尿中或血清YKL-40濃度與進(jìn)行性腎損傷相關(guān)，可能是腎移植患者群體心血管損傷發(fā)病的原因[12-13]。目前尚未見YKL-40在腎結(jié)核患者中表達(dá)的研究。本文通過分析YKL-40在腎結(jié)核和正常對照個體血清中的濃度以及在腎結(jié)核組織中的表達(dá)情況，并與qRT-PCR方法診斷價值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，相對于健康人群來說，YKL-40在腎結(jié)核患者血清中的表達(dá)水平升高。而在比較腎結(jié)核患者病變組織和周圍健康組織YKL-40的表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)，病變組織YKL-40水平也高于健康組織。表明YKL-40可能參與腎結(jié)核的發(fā)生過程。YKL-40與qRT-PCR診斷腎結(jié)核一直是臨床研究的重點，由于YKL-40是近年來出現(xiàn)的診斷指標(biāo)，部分學(xué)者仍然習(xí)慣性采用qRT-PCR進(jìn)行檢測，認(rèn)為qRT-PCR對腎結(jié)核診斷率較高。但在比較YKL-40和qRT-PCR診斷對腎結(jié)核時發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR檢出腎結(jié)核陽性率32.61%，YKL-40檢出腎結(jié)核陽性率47.83%，YKL-40檢出腎結(jié)核陽性率高于qRT-PCR。比較兩種診斷方法對腎結(jié)核診斷效能時發(fā)現(xiàn)，YKL-40對腎結(jié)核的診斷效能優(yōu)于qRT-PCR。YKL-40可能是通過多種機(jī)制在腎結(jié)核的發(fā)生發(fā)展中起到作用，可有效反映腎結(jié)核的活動及病變范圍，相對于qRT-PCR檢測效果更佳。

綜上所述，YKL-40的檢測對腎結(jié)核患者的診斷效能較高。