利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術應用于兒童肺結核快速診斷的效果

黃 晴

(武漢市醫療救治中心結核科，湖北 武漢 430040)

兒童是結核病易感人群之一，全球每年新發兒童結核病病例約達53.5萬，占所有新發病例的10%～15%[1]。早期明確診斷、及時治療對改善患兒預后尤為重要。近年來，核酸檢測技術在兒童結核病診斷上引起臨床廣泛關注，研究顯示，該檢測技術在兒童結核病快速診斷中的敏感度達40%～60%[2]。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF)為眾多研究證實在成人肺結核診斷中敏感度、特異度均較高，但關于其在兒童肺結核中的報道極為少見[3，4]。本研究旨在探討Xpert MTB/RIF在快速診斷兒童肺結核中的應用價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2013年6月至2017年12月我院收治經臨床診斷的120例肺結核患兒，均符合兒童肺結核診斷標準[5]，取樣前均無抗結核治療史，符合支氣管鏡檢查適應證，患兒監護人均簽署研究知情同意書。年齡3個月至14歲，中位年齡7歲。

1.2 檢測方法

1.2.1標本采集 應用Olympus BF-P260F型纖維支氣管鏡。檢查前，根據患兒年齡選擇麻醉方式，其中≤7歲者選用異丙酚靜脈復合麻醉，>7歲者應用利多卡因氣管內黏膜表面麻醉。使患兒行仰臥位，支氣管鏡由鼻腔入，對病變情況進行仔細檢查后，采取導管由病灶部位注入一定量0.9%NaCl溶液，留取肺泡灌洗液。取適量肺泡灌洗液，均分為二份，一份留待行羅氏培養，一份留待行Xpert MTB/RIF檢測，余下肺泡灌洗液冷凍備存。

1.2.2羅氏培養 參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]中相關方法流程，進行結核分枝桿菌羅氏培養和比例法藥敏試驗。

1.2.3Xpert MTB/RIF檢測 向所采集的肺泡灌洗液中加入等體積消化液，振搖數次。室溫下靜置10～15 min，待洗液可見成分消失時，抽取2 ml，置入Xpert MTB/RIF反應試劑盒中，接著將反應試劑盒置入4通道Gene Xpert平臺中，運行120 min后觀察結核分枝桿菌檢測結果，并對陽性標本行利福平耐藥檢測。整個過程嚴格按試劑盒說明書進行。試驗結果采用盲法進行評價，計算兩種檢測方法的陽性率。

1.3 統計學方法應用SPSS 20.0軟件處理研究數據。計數資料比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法檢測結核分枝桿菌的結果120例灌洗液，羅氏培養顯示，25例陽性，陽性率為20.83%(25/120)；Xpert MTB/RIF檢測顯示，74例顯示陽性，陽性率為61.67%(74/120)。羅氏培養的25例陽性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌陽性率為96.00%(24/25)，95例陰性標本中，Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌陽性率為52.63%(50/95)。兩種方法檢測結核分枝桿菌的陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=44.672，P<0.05)，見表1。本研究由于未缺少非結核桿菌組，故不評價Xpert MTB/RIF檢測的特異性。

表1 兩種方法檢測結果對比 (n)

2.2 Xpert MTB/RIF方法的檢測次數對最終檢測結果的影響經羅氏培養顯示陽性而采取Xpert MTB/RIF進行第一次檢測結果有3例顯示陰性，行第二次檢測其中2例得到陽性結果，靈敏度為96.00%(24/25)，與首次檢測的88.00%(22/25)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 兩種方法檢測利福平耐藥結果羅氏培養25例陽性標本經比例法藥敏試驗顯示利福平耐藥者3例，耐藥率達12.00%(3/25)；比例法藥敏顯示的3例耐藥標本中，經Xpert MTB/RIF檢測均顯示耐藥，敏感度為100.00%(3/3)；而比例法藥敏顯示的22例敏感者中，經Xpert MTB/RIF檢測顯示有1例耐藥，特異度為95.45%(21/22)。

3 討論

自抗結核藥物問世以來，結核病預后得以明顯改善，然而近年隨著結核分枝桿菌耐藥現象日益嚴重，結核病又出現重新蔓延，再次成為全球性公共衛生問題。及早明確診斷并根據藥敏試驗結果予以針對性治療具有重要意義。目前，羅氏培養及比例法藥敏試驗雖是診斷耐藥性肺結核的“金標準”，但培養周期長達4～8周，藥敏試驗亦需4周方可取得結果，較多患者因未能及時取得診治而延誤病情，導致不良預后甚至造成患者死亡[7]。兒童肺結核患者較成人負擔更重，報道顯示，20%以上經培養證實的結核病患兒在未取得有效治療前已轉院或失訪；而臨床診斷的結核病患兒中，最終接受抗結核治療的比例僅為44%[8，9]。因此，尋找快速診斷兒童肺結核的檢測方法具有迫切性。

Xpert MTB/RIF檢測是一種巢式PCR體外診斷技術，其通過檢測結合分枝桿菌上rpoB基因及利福平耐藥相關81bp的核心區間，從而實現對結合分枝桿菌感染情況及其利福平耐藥情況的診斷，該檢測操作簡便，全程自動化，且在120 min內完成[10，11]。巢式PCR的使用使診斷敏感度得以顯著提高，并在極大程度上減少了非特異性擴增。鑒于絕大部分結合分枝桿菌在對利福平耐藥的同時亦對異煙肼耐藥，故在某種程度上檢測利福平耐藥情況即可反映結合分枝桿菌多藥耐藥情況[12]。近年來，Xpert MTB/RIF檢測在各臨床標本中有著廣泛應用，應用價值得到較多研究證實。Pimkina等[13]報道Xpert MTB/RIF對培養陽性的肺結核診斷的敏感度為93.7%，特異度為91.7%。路麗蘋等[14]研究顯示，Xpert MTB/RIF診斷結核病的敏感度高于涂片法，且對利福平耐藥檢測的敏感度、特異度均超過90%。Xpert MTB/RIF檢測已成為WHO推薦的肺結核診斷技術，但其在兒童肺結核診斷上尚缺乏有效研究證實。

本研究采用Xpert MTB/RIF檢測經肺泡灌洗液羅氏培養證實的肺結核患兒，靈敏度為96.00%。但羅氏培養顯示的95例陰性標本中，用Xpert MTB/RIF檢測的陽性率為52.63%，可見Xpert MTB/RIF檢測提高了兒童肺結核的診斷能力。在檢測利福平耐藥結果上，以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥的敏感度為100.00%，特異度為95.45%。敏感度高達100.00%可能與納入病例數較少有關，該檢測系統是根據rpoB耐藥決定區81bp范圍內序列對利福平耐藥相關ropB基因進行檢測的，設計了5對探針熒光基因，并未覆蓋全部突出位點。國外學者[15]采用Xpert MTB/RIF檢測系統對肺結核兒童(年齡<15歲)進行檢測，結果顯示靈敏度為74.0%，明顯低于FIND基金會[16]報道的成人肺結核的98.2%。本研究Xpert MTB/RIF對肺結核患兒肺泡灌洗液檢測敏感度僅為61.67%，低于上述研究，可能與采集標本含菌少、合格率低有關。本研究中有3個標本首次檢查時顯示陰性結果，可能與標本處理質量差或試劑盒存在質量問題等使得DNA擴增受限有關。此外，Xpert MTB/RIF檢測在120 min內完成，全程自動化、封閉化，不僅快速，且安全性高。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測在兒童肺結核診斷及利福平耐藥判斷上效果優于羅氏培養，能夠為早期診療提供重要幫助，且具有簡捷、快速、陽性率高等特點，適合基層醫院推廣，應用前景廣闊。