甲基綠與吡羅紅染色效果及染色機理的探析

福建 四川

現行高中生物教材（人教版、浙科版、北師大版、蘇教版）中都介紹了利用甲基綠、吡羅紅（又稱派洛寧、焦寧）混合染液對細胞進行染色，從而觀察DNA和RNA在細胞中的分布。教材中該染色實驗比較強調甲基綠、吡羅紅需要先混合再進行染色，但在高考試題中還多次考查了甲基綠單獨染色的實驗效果。為驗證甲基綠和吡羅紅單獨染色、混合染色和分染的實驗效果，筆者嘗試以對高考試題分析著手，依據實際實驗結果探討兩種染液的染色機理和部分高考試題。

1.高考原題再現

【例1】（2012年，江蘇卷，第19題）表1中有關人體細胞化合物的各項內容，正確的是 （ ）

表1

A.① B.② C.③ D.④

【參考答案】C

【分析】例1的④被排除在正確選項之外，江蘇省考試院給出本題④選項的解析為“核酸包括DNA和RNA，甲基綠染液僅是DNA的染色劑，故D選項錯誤”。可見該題命題者認為甲基綠染液僅是DNA（脫氧核糖核酸）的染色劑，不能與RNA（核糖核酸）作用呈現顏色。類似試題還有2009年江蘇卷第21題D選項。

【例2】（2016年，海南卷，第15題節選）下列實驗中，加入試劑后不能產生特定顏色的是 （ ）

B.黑暗中生長24 h的天竺葵葉片，用碘液檢測淀粉

C.玉米根尖經甲基綠染色后，在顯微鏡下觀察細胞核

【參考答案】B

【分析】本題的C選項考查甲基綠單獨染色效果——在顯微鏡下可以觀察到細胞核呈綠色。教育部考試中心給出的C選項的解析為“甲基綠溶于水，顯藍綠色，為堿性染料，甲基綠與DNA的親和力很強，能使DNA呈現綠色，因此玉米根尖經甲基綠染色后，在顯微鏡下觀察細胞核被染成綠色”。類似試題還有2014年重慶卷第1題A選項和2008年江蘇卷第4題D選項。

2.甲基綠、吡羅紅單獨染色實驗效果驗證

以洋蔥鱗片葉內表皮細胞為材料，利用0.15%甲基綠單獨染色時染色效果如圖1和圖2所示，由圖可知，甲基綠在單獨染色時能將細胞核染成明顯的藍綠色（圖中深色部分），同時細胞質部分也呈現淡綠色。本實驗同樣利用了2%吡羅紅對洋蔥鱗片葉內表皮細胞進行染色，染色效果如圖3和圖4所示，發現吡羅紅在單獨染色時能將洋蔥鱗片葉內表皮細胞核染成較深的紫紅色（圖中深色部分），細胞質部分也呈現淡紅色。該實驗驗證了甲基綠單獨染色時細胞核和細胞質都顯出綠色，吡羅紅單獨染色時細胞核和細胞質都顯出紅色。在顯微鏡下都可以清晰地觀察到細胞核，例2等相關選項與實驗結果相符。

圖1 酸解后，0.15%甲基綠染色效果

圖2 不酸解，0.15%甲基綠染色效果

圖3 酸解后，2%吡羅紅染色效果

圖4 不酸解，2%吡羅紅染色效果

3.甲基綠、吡羅紅混合染色法與分染法實驗效果驗證

在“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”的教材實驗中，通常采用甲基綠、吡羅紅混合染色法進行實驗。但因當前市場上沒有甲基綠和吡羅紅的混裝粉出售，故采用的是以下方法配制兩種染液：分別取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中制成2%的甲基綠溶液，取吡羅紅5g溶于95mL蒸餾水中制成5%的吡羅紅溶液，放入棕色瓶中備用。經多次實驗發現，實驗成功有幾個關鍵影響因素：①染液的pH：pH偏高時吡羅紅不易著色，pH偏低時甲基綠不易著色，pH為4.8時染色效果最好。故實驗中可利用pH為4.8的緩沖液代替蒸餾水沖洗，保證染色時處于適宜的pH條件下。②甲基紫的影響：甲基綠久置易產生甲基紫，在染色過程中容易使細胞核偏紫色。因甲基紫溶于氯仿，故可利用氯仿抽提除去甲基紫，排除甲基紫對實驗的干擾。③酸解的影響：鹽酸濃度太高易引起洋蔥鱗片葉內表皮細胞發生嚴重的質壁分離；解離過度還易使細胞核偏向藍紫色，2%的鹽酸解離2min再染色或不解離直接染色效果更好。④材料的新鮮程度：材料不新鮮，其DNA和RNA可能發生降解，導致細胞核染色后偏向紫色，而細胞質不著色。⑤染色的時長：甲基綠易進入細胞使細胞核染色，對細胞質的染色則很淺；吡羅紅進入細胞的速率相對較慢，對細胞質染色較深，但也會與細胞核結合，染色時間過長易使細胞核偏向藍紫色。⑥兩種染料的配比：若吡羅紅比例偏高，則細胞質呈紅色，細胞核偏向紫色；若吡羅紅比例偏低，則細胞質著色很淺，只有適當的濃度和配比才能在染色后使細胞核呈綠色，細胞質及核仁呈紅色。但因購置的藥劑純度通常不同（甚至未標注純度），使得不同文獻給出的試劑配比有較大差別，如陳小輝的《洋蔥內表皮細胞中DNA和RNA染色方法的改進》。此外，甲基綠和吡羅紅在配制過程中都存在較多不溶解的雜質，需要過濾后再使用，使得所配制的溶液實際濃度更加難以確定，故教師在實驗前需要先做預實驗以確定合適配比。經多次實驗發現，以0.15%的甲基綠和2%的吡羅紅混合染色劑，染色1～2min，效果較好，酸解后染色，細胞核呈藍色；如果不酸解直接染色，細胞核常呈綠色或藍綠色，最接近教材效果（如圖5和圖6所示）。

圖5 酸解后，0.15%的甲基綠，2%的吡羅紅混合染色

圖6 不酸解，0.15%的甲基綠，2%的吡羅紅混合染色

圖7 酸解后，先用0.15%的甲基綠染色，再用2%的吡羅紅染色

圖8 酸解后，先用0.15%的甲基綠染色，再混合染色

沈曉蜜在《對“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”實驗的幾點思考》中指出，本實驗也可以采用分染法進行。實驗發現，先用一種染料染色后，再用另一種染料覆蓋染色，細胞質顏色先被置換，隨后細胞核顏色變成兩種染料的混合色。將材料酸解后，先用0.15%的甲基綠染色 3min，利用緩沖液洗去浮色，再用2%吡羅紅染色30s左右，立即將吡羅紅吸去，洗去浮色，效果也較好，并且可以觀察到核仁被染成紅色（如圖7所示）；若材料不經酸解，吡羅紅染色時間需延長至3～4min。調換染色順序，細胞質先被置換成綠色，細胞核卻仍是紅色，隨染色時間延長慢慢向藍紫色變化，說明吡羅紅與細胞核結合較緊密，較難被甲基綠置換。實驗中，材料經酸解后，先用0.15%的甲基綠染色3min，再以0.15%的甲基綠和2%的吡羅紅混合染色劑染色2min，效果也很好（如圖8所示）。

混合染色或分染時，若細胞質呈明顯紫色，細胞核常呈偏藍色或藍紫色，究其原因：甲基綠進入細胞較快，先結合細胞核使之呈綠色，但隨著染色時間延長，吡羅紅進入細胞后容易與甲基綠競爭結合DNA，而使細胞核逐漸從綠色變換成藍色，進而呈藍紫色或紫色。鹽酸水解可以使染色劑更易進入細胞，使細胞染色均勻，而吡羅紅也可快速進入細胞，與細胞核結合，使細胞核呈藍色。

4.兩種染液染色機理探析

人教版高中生物教材在“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”實驗中給出甲基綠、吡羅紅染色原理：“甲基綠和吡羅紅兩種染色劑對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現綠色，吡羅紅使RNA呈現紅色。利用甲基綠、吡羅紅混合染色劑將細胞染色，可以顯示DNA和RNA在細胞中的分布。”教材中只是提到兩種染色劑與DNA和RNA的親和力不同，但師生卻容易誤認為甲基綠僅能與DNA結合使其呈現綠色，吡羅紅僅能與RNA結合使其呈現紅色。

從分子結構分析，DNA和RNA中含堿基和磷酸基團，堿基上一些含孤對電子的N或其他基團可以接受質子或釋放質子，從而帶正電或負電；核苷酸鏈末端的磷酸基團可以兩步解離，釋放兩個質子，其余絕大多數的磷酸基團只存在一步解離，因釋放出一個質子而帶負電，故在水溶液中核酸可以看作是兩性電解質。磷酸基團的酸性較堿基的堿性強，故核酸通常表現為酸性（帶負電荷），容易與帶正電荷的堿性染料以離子鍵或氫鍵的形式相結合。DNA的磷酸基團排列在雙螺旋結構的外側，更容易電離而帶負電荷；RNA除了因磷酸基團容易電離帶負電荷外，其堿基也常暴露在外，解離后而帶正電或負電。由于DNA和RNA的堿基組成、結構以及分子大小不同，兩者的等電點不同，在同一種pH溶液中的帶電性也有所不同。

甲基綠和吡羅紅的發色基團均為醌基，電離后帶一個正電荷，故甲基綠、吡羅紅都為堿性染料。兩者都能與DNA及RNA結合，只是親和力有所不同。甲基綠和吡羅紅混合染色時分別與DNA和RNA特異性結合可能與DNA和RNA不同的聚合度有關。在合適的pH條件下（約為4.8）混合染色時，兩種染料與核酸的結合有競爭作用，甲基綠易與聚合程度高、負電性強的DNA競爭結合，呈現綠色或藍綠色，而吡羅紅則易與聚合程度較低、負電性相對較弱的RNA（核仁、細胞質中的RNA）競爭結合，呈現紅色，此外解聚的DNA也能與吡羅紅結合呈現紅色或紫色。若鹽酸解離過度或材料不夠新鮮，導致DNA降解，也易使細胞核呈紫色。

結合上述實驗效果驗證，DNA與RNA都可以與甲基綠結合而呈綠色或都可以與吡羅紅結合呈紅色。例1中試題的相關選項的觀點有待商榷。另外，細胞核中DNA的量多而密集，故甲基綠、吡羅紅單獨染色時，細胞核都易被染成較深的綠色或紅色，在顯微鏡下很容易觀察。

5.實驗結論與教學建議

本實驗目的是利用甲基綠和吡羅紅對DNA和RNA的親和力差異，以顯示DNA和RNA在細胞中的分布，由于甲基綠和吡羅紅對DNA和RNA染色僅僅是親和力差異，但特異性結合不強，所以在實際操作中細胞核容易出現兩種顏色混合的現象，難以達到較好的實驗效果。在實驗教學中，教師可以順勢引導學生深入探討相關原理，鼓勵學生進一步對實驗進行分析和探究，將簡單的重復驗證教材實驗變為趣味性、科學性更強的探究性活動，培養學生的科學思維和科學探究能力，這也順應了高考注重科學探究素養的考查，促進學生學核心素養的養成。