基于MLST鄱陽湖微囊藻的遺傳多樣性及其系統發育

柳滿森,蔡芳芳,王一郎,霍 達,虞功亮,李守淳*,李仁輝*

基于MLST鄱陽湖微囊藻的遺傳多樣性及其系統發育

柳滿森1,蔡芳芳2,3,王一郎2,3,霍 達2,3,虞功亮2,李守淳1*,李仁輝2*

(1.江西師范大學生命科學學院,江西 南昌 330500；2.中國科學院水生生物研究所藻類生物學重點實驗室,湖北 武漢 430072；3.中國科學院大學,北京 100049)

為了研究鄱陽湖微囊藻的遺傳多樣性及其系統發育關系,基于7個管家基因(Z、A、X、B、、A和),建立了一個多位點序列分型( MLST)方法.對來自鄱陽湖的20株微囊藻分離株進行MLST研究,并構建本地微囊藻MLST基因庫.結果表明:這20株藻株具有20種獨特的序列型(STs),揭示了微囊藻高水平的遺傳多樣性(=0.986).基于7個MLST位點串聯序列的系統發育分析顯示,微囊藻藻株序列型可分為5個不同的組.與之前日本湖泊研究的237個STs共建的系統發育樹比對表明,本研究的STs形成了獨立的分枝.該結果說明不同地區的微囊藻是相對穩定的,因此可以用MLST進行明確的表征.

水華；微囊藻；MLST；遺傳多樣性；鄱陽湖；系統發育

微囊藻()是淡水環境中最常見和分布最廣泛的水華藍藻種類[1].微囊藻水華暴發會導致一系列環境問題[2-3].其對水環境污染和人類飲水健康的影響成為人們關注的焦點和熱點[4].微囊藻是一類能形成群體的單細胞藍藻,在富營養化的淡水環境大量繁殖.根據傳統的形態學分類,微囊藻屬內有10多個常見的種[5].但是由于微囊藻群體形態特征高度可變,而且這種變化有時會超過形態學分類標準,因此微囊藻屬種水平分類也被提出過異議.根據細菌分類學方法,單個基因序列如16S rRNA基因序列以及16S~23S之間的ITS序列由于保守性很強,并不能將微囊藻屬內的種很好地區分開來[6].近年來,微囊藻許多藻株的全基因組測序結果顯示,盡管不同藻株特有基因占比很大,但是核心基因的相似度仍能很高[7].多位點序列分型(MLST)是通過分析多個管家基因序列,對不同微生物株系的等位基因進行多樣性比較,不同的株系對應不同的序列型.所以MLST方法越來越多地作為微生物株系間多樣性比較的工具,也常常應用于生物進化和種群結構的研究.實際上MLST是介于單基因和全基因組之間的有效而又含有足夠遺傳信息量的分析方法,但是在藍藻的遺傳多樣性研究中,只有日本學者利用MLST對日本湖泊中分離的微囊藻藻株進行過遺傳多樣性和基因重組研究[8-9],世界其它地區未見報道.我國已經成為一個微囊藻水華暴發頻繁和暴發范圍廣泛的國家,對我國微囊藻藻種的多樣性研究是迫切需要的.

鄱陽湖是我國第一大淡水湖,水文環境復雜,但是近年來的環境變化使鄱陽湖每年形成藍藻水華.本研究從鄱陽湖分離獲得了20株微囊藻并采用MLST方法對這20株微囊藻進行遺傳多樣性及系統發育研究,以期揭示其群體遺傳多樣性,探究管家基因及對應產毒株的分型,探討不同地區微囊藻遺傳多樣性的差異.這是國內首次使用MLST方法研究微囊藻遺傳多樣性、產毒株分型及系統發育分析.

1 材料與方法

1.1 藻株分離與培養

本研究的20株微囊藻藻株經過形態學鑒定,分屬于4個形態種:11株銅綠微囊藻(),3株惠氏微囊藻(),3株魚害微囊藻(),3株綠色微囊藻().這些藻株均是采用經典毛細管分離法分離自鄱陽湖,所有藻株分離純化后轉移至裝有5mL含有無菌MA培養基的玻璃試管中培養,培養條件為溫度25℃,光照強度30 μmol protons/(m2·s),光照周期為12h/12h(光:暗)[10].

1.2 微囊藻藻株MLST

MLST采用7個管家基因,分別為Z,A,X,B,,A,.每個基因座都是以單拷貝形式存在.使用傳統CTAB法提取所有微囊藻藻株DNA,通過PCR進行擴增,7個管家基因的引物如表1,PCR擴增體系為50μL,反應條件為:94℃預變性3min, 94℃變性60s,60℃退火30s,72℃延伸30s,此3個過程為35個循環,接著72℃終延伸5min.PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將對應陽性條帶切下,并使用BioFlux試劑盒進行回收.產物回收后構建質粒載體,轉化大腸桿菌DH5α,并挑選陽性克隆進行測序,最終將得到的序列去接頭.查閱相關文獻[8-9,11],利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載相關基因座序列,構建微囊藻MLST本地基因庫,將本研究序列與本地基因庫進行比對,對于每個基因座,每個不同的等位基因都被分配一個不同的任意數字,而7個等位基因的唯一組合明確地定義了一個藻株的序列類型(ST).

1.3 毒素基因檢測

使用引物EF2和ER4(如表1),檢測微囊藻毒素合成基因E,退火溫度為55℃,其余條件與擴增管家基因相同.并采用酶聯免疫反應檢測擴增出E基因潛在產毒株的毒素含量.

表1 MLST中使用的PCR引物序列與mcyE基因PCR引物序列

1.4 遺傳學與系統發育分析

使用軟件DNAsp分析DNA遺傳多樣性指數,公式如式(1):

(=[/(-1)](1-∑2) (1)

式中:是樣本數量,p是第個等位基因的相對頻率.

同時分析核苷酸多樣性[12],和基于田島的中性測試[13].系統發育分析使用SequenceMatrix v1.7.8將7個基因按Z-A-X-B--A-的順序串聯起來;使用CLUSTAL X v2.0將序列比對裁剪對齊;使用MODELTEST v3.7[14]和PAUP* v4.0b10[15],推斷模型和計算參數,推斷出的最佳模型為GTR+I+G;使用MEGA v7構建鄰接樹(NJ);使用IQ-tree 構建最大似然樹[16];最后使用Figtree v1.4.3對獲得的系統發育樹進行編輯.

2 結果與分析

2.1 MLST

采用表1所示的引物均成功從20株微囊藻中擴增得到7個MLST基因片段.與構建的微囊藻MLST本地基因庫進行比對,分型.確定了20個不同的ST型(ST238-ST257)如表2所示,每株藻都各自代表了不同的STs,LMS01-LMS20來源于鄱陽湖的不同區域,分別為修水口5株,湖口及主航道3株,老爺廟水域3株,蚌湖水域8株,青嵐湖1株(表2).結果說明本研究所采用的7個管家基因可有效的對微囊藻藻株進行分型,同一地點與不同地點均有很高的遺傳多樣性.

表2 20株鄱陽湖微囊藻藻株的序列型及對應的等位基因編號

2.2 遺傳多樣性

表3 基因多樣性指數

注::等位基因數;:基因多樣性;:核苷酸多樣性; **:<0.01極顯著; *:<0.05顯著

測序序列去除兩端載體序列后,在任何位點的序列中均未發現插入或刪除,因此序列可以明確對齊.由DNAsp 軟件計算的遺傳多樣性指數如表3所示.基因片段長度在440~502bp不等,平均總核苷酸離散度(×100)為29%,最大值為的31.8%,最小值為X的27.7%,ST等位基因數從X的16到B的19不等,7個基因座的平均基因多樣性為0.986. tajima’值則表明了顯著的相關性.

2.3 毒素基因檢測結果

以微囊藻毒素E為擴增目標的一對引物檢測鄱陽湖20株微囊藻藻株的潛在毒性[16].通過擴增E基因,11株微囊藻發現了毒素基因,9株未發現毒素基因.對擴增的毒素基因進行測序后blast比對,所有結果均為陽性.對潛在產毒微囊藻藻株進行酶聯免疫反應檢測,結果表明:11株潛在產毒株中有8株檢測到了毒素.最終,20株微囊藻藻株中,8株為產毒株,3株有毒素基因但不產毒株,9株不具備產毒基因(圖1).

圖1 基于7個MLST位點的串聯序列20株微囊藻鄰接系統發育樹

A組代表有毒素基因的無毒株,B、C組代表產毒株,D組代表無毒株,E組代表產毒株與無毒株混合組

2.4 系統發育分析

單個MLST基因系統發育分析無法解決系統發育關系的置信度.因此,本文連接了7個MLST基因序列,獲得了總長為2992bp的序列[17].使用MODELTEST軟件進行分層似然比檢驗,進行多位點串聯序列進化分析,結果顯示:最優模型為GTR+ I+G,ATCG,4種堿基的頻率分別為0.2511,0.2647, 0.2385,0.2458.替代模型速率矩陣為()[-]= 0.9718,()[-]=2.2497,()[-]=1.0052,()[-]=1.1882,()[-]=2.1818,()[-]=1.0000. 從選定的模型和參數推斷出的鄰接系統發育樹(圖 1)可看出藻株之間的關系能夠得到明顯的體現,20 個序列型分為2個大枝,把步展值大于90的分為同一組,可以分為5個組,D組為無毒株,除此之外,還有ST242,ST254,ST257和ST239為單枝上的無毒株,A組為有毒素基因的無毒株,另有一株與無毒株ST239聚在了一起,B組C組均為產毒株,而E組同時包含產毒與無毒株,這一組獨立于其他4個組.

形態學鑒定結果顯示:ST238、ST243、ST247為綠色微囊藻,其中ST243、ST247在系統發育樹中的B組,ST238在E組,均為產毒株:ST239、ST241、ST244、ST245、ST246、ST248、ST250、ST251、ST252、ST254、ST256為銅綠微囊藻,分散在A、C、D、E組,產毒株,不產毒株,有毒素基因不產毒株均有分布:ST240、ST249、ST255為魚害微囊藻,其中ST240、ST249在E組,為產毒株,ST255在A組,為有毒素基因的無毒株:ST242、ST253、ST257為惠氏微囊藻, ST242、ST257存在于單枝上,ST253在D組,3株均為無毒株.

從采集位點看,修水口5株藻株位于系統發育樹的單枝及E組:主航道3株藻株位于B、E組,蚌湖水域8株藻株在各組中均有分布,青嵐湖1株藻株位于單枝上,老爺廟水域3株藻株位于單枝及A組.

3 討論

3.1 微囊藻高遺傳多樣性

微囊藻遺傳多樣性研究可以使用多種方法進行,本研究MLST方法分析我國微囊藻藻株的遺傳多樣性,這種方法在細菌特別是病原菌株系方面已有較多研究.雖然本次研究的微囊藻藻株有限,分離地點也具有隨機性,但結果仍表明,鄱陽湖的微囊藻藻株具有很高的遺傳多樣性.所有基因座具有高分子多態性,每個基因座至少包含19個等位基因點,平均基因多樣性為0.986,這遠遠高于大腸桿菌(= 0.39)[18],枯草芽孢桿菌(=0.44)[19],也高于日本的微囊藻藻株(=0.951)[8].鄱陽湖微囊藻高水平的遺傳多樣性,可能是微囊藻包含多個不同的生態類型,這也反映出鄱陽湖包含許多不同的生境,這些生境差異往往會伴隨遺傳差異.如果一個物種存在更多的生態類型,那么這個物種就會保持更高的遺傳多樣性[20],隨著時間的推移,每個生態型都有屬于自己基于基因序列的分枝.微囊藻系統發育樹中觀察到許多不同的分枝,這表明每個分枝可能代表一個特有的生態型.

3.2 產毒與不產毒藻株系統發育關系

MLST結果顯示,產毒株和不產毒株在MLST等位基因譜上存在差異,本文構建鄰接系統發育樹,探討產毒株與不產毒株的系統發育關系.如圖1可以看出,B組和C組均為產毒株,而在E組中,同時出現了產毒與無毒株,這些不一致基因型的存在可能使E基因功能喪失,突變或是異位[21].在微囊藻中,氣囊基因也曾報道過基因功能喪失[22].在A組中,擁有E基因卻不產毒,通過比對E基因序列發現,B組E序列與其他產毒序列都有差別,相對于產毒序列,它含有堿基差異.雖然我們還沒有發現這一突變是否與微囊藻毒素丟失直接相關,但已有報道稱堿基差異會使微囊藻的產毒株演變為無毒株[21,23-24].而另一個認為藻株無毒的原因可能是,這些藻株中產生的微囊藻毒素濃度過低,無法通過ELLSA檢測到,但是本文取對數生長期的微囊藻培養液,稀釋梯度倍數,進行檢測,結果是可信的.

本研究中16S rRNA基因序列無法有效的區分產毒株與不產毒株.有大量研究表明微囊藻16S rRNA基因高度保守,超過99.5%的序列相似度,無法進行種水平鑒定.本研究的鄱陽湖的微囊藻藻株的16S rRNA 基因序列結果和大量研究結果類似,也是大于99.5%,并且MLST與16S rRNA系統發育與多位點序列分型無相關性.同樣,形態學鑒定結果與系統發育樹比較,結果表明,綠色微囊藻均產毒,惠氏微囊藻均不產毒,魚害微囊藻與銅綠微囊藻兩者都有,所有藻株分散于不同組中,與產毒分型沒有顯著的相關性.大量證據表明微囊藻各形態種產毒比例為綠色微囊藻>銅綠微囊藻>魚害微囊藻>惠氏微囊藻,與本研究的結果相同.

3.3 微囊藻MLST系統發育樹

本研究20個微囊藻藻株分布于鄱陽湖不同水域,蚌湖水域采集藻株較多,在每組中均有分布,其他水域采集藻株較少,分散于不同組,結果表明:使用多位點分型無法有效的對鄱陽湖藻株進行分型,本文認為是鄱陽湖水文環境復雜,水體交換頻繁,不同水域微囊藻具有遷移的可能性.而使用鄱陽湖20個藻株與日本湖泊237個藻株,構建鄰接系統發育樹(圖2).結果顯示:本研究的19株(ST242例外),完全獨立于日本湖泊的藻株.盡管本文采用了7個管家基因,相對保守,構建的系統樹卻形成了明顯的分支.有研究表明時空變化會導致基因的差異,長時間的地理差異進化,會形成地理隔離[25].日本湖泊與中國鄱陽湖有著較大的地理差異,因為日本湖泊基本是處于溫帶,而鄱陽湖則處于亞熱帶.所以可能是生態環境的差異是引起兩者獨立成枝的重要因素之一.當微囊藻株存在地理差異時,必須考慮到細微的時空遺傳變異,這為進一步研究更大樣本、更好地納入環境變量的微囊藻的微進化以及進一步了解微囊藻的環境適應提供了基礎.

圖2 基于鄱陽湖與日本湖泊的微囊藻藻株ST型的系統發育樹

由于生態與環境的重要性,一個可靠的基因分型方法能為監測控制微囊藻水華提供基礎.本文使用的MLST方法,已經證明可以用它來明確地描述克隆的基因型.事實上,MLST可以區分超過5500億個多位點基因型[26],具有高分辨率.因此期望MLST適用于全世界的微囊藻等藍藻的DNA序列分型.MLST的結果可比較,很容易與其他研究人員的研究結果相結合,因此MLST將成為研究微囊藻全球種群結構的一個非常有價值的工具.在本文中,使用MLST方法對鄱陽湖微囊藻藻株DNA分型,證明了它們較高的遺傳多樣性,通過系統發育分析識別出產毒株和無毒株[27].今后通過更廣泛更集中的藻株檢測,構建更龐大的MLST數據庫,這對其產毒株分型及種群遺傳學,如基因流、自然選擇等的研究定有很大的幫助.

4 結論

4.1 鄱陽湖20株微囊藻確定了20個不同的STs.

4.2 微囊藻多位點基因序列長度在440~502bp不等,平均核苷酸離散度為29%,平均基因多樣性指數為0.986.

4.3 20株微囊藻通過系統發育分析,可以分為5個組,A組為有毒素基因的無毒株,另有一株與無毒株ST239聚在一起,B組C組均為產毒株,D組為無毒株, ST242,ST254,ST257和ST239為單枝上的無毒株,而E組同時包含產毒與無毒株,這一組獨立于其他4個組.

4.4 基于7個串聯基因系統發育關系表明,鄱陽湖微囊藻的20個STs,基本上獨立于日本湖泊微囊藻的237STs(ST242除外).

[1] Harke M J, Steffen M M, Gobler C J, et al. A review of the global ecology, genomics, and biogeography of the toxic cyanobacterium,spp [J]. Harmful Algae, 2016,54(SI):4-20.

[2] Mohamed Z A, Deyab M A, Abou-Dobara M I, et al.Occurrence of cyanobacteria and microcystin toxins in raw and treated waters of the Nile River, Egypt: implication for water treatment and human health [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2015,22(15): 11716-11727.

[3] Nolen R S. A one-health solution to the toxic algae problem [J]. Javma-Journal of the American Veterinary Medical Association, 2018, 252(8):906-909.

[4] Otsuka S, Suda S, Shibata S, et al. A proposal for the unification of five species of the cyanobacterial genusex Lemmermann 1907under the Rules of the Bacteriological Code [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001,51(3):873-879.

[5] Schmidt J R, Wilhelm S W, Boyer G L. The fate of microcystins in the environment and challenges for monitoring [J]. Toxins, 2014, 6(12):3354-3387.

[6] Huo D, Chen Y, Zheng T, et al. Characterization of microcystis (Cyanobacteria) genotypes based on the internal transcribed spacer region of rRNA by next-generation sequencing [J]. Frontiers in Microbiology, 2018,9:971.

[7] Yang C, Lin F, Li Q, et al. Comparative genomics reveals diversified CRISPR-Cas systems of globally distributed, a freshwater bloom-forming cyanobacterium [J]. Front Microbiol, 2015,6:394.

[8] Tanabe Y, Kasai F, Watanabe M M. Multilocus sequence typing (MLST) reveals high genetic diversity and clonal population structure of the toxic cyanobacterium[J]. Microbiology- Sgm, 2007,153(11):3695-3703.

[9] Tanabe Y, Kasai F, Watanabe M M. Fine-scale spatial and temporal genetic differentiation of water bloom-forming cyanobacterium: revealed by multilocus sequence typing [J]. Environmental Microbiology Reports, 2009,1(6):575-582.

[10] Huo D, Cao Q, Wang S Y, et al.The spatial distribution ofand microcystin and its relationship with environmental factors in Haihe Tianjin City [J]. China of Environmental Science, 2018,38(10): 3897-3903.

[11] Feil E J, Holmes E C, Bessen D E, et al. Recombination within natural populations of pathogenic bacteria: Short-term empirical estimates and long-term phylogenetic consequences [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001,98(1):182-187.

[12] Rozas J, Sanchez-Delbarrio J C, Messeguer X, et al. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods [J]. Bioinformatics, 2003,19(18):2496-2507.

[13] Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism [J]. Genetics Society of America, 1989,123(3): 585-595.

[14] Zhang N, Zeng L, Shan H, et al. Highly conserved low-copy nuclear genes as effective markers for phylogenetic analyses in angiosperms [J]. New Phytologist, 2012,195(4):923-937.

[15] Swofford D L. Phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods) [Z]. 2002.

[16] Lam-Tung N, Schmidt H A, Von Haeseler A, et al. IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies [J]. Molecular Biology and Evolution, 2015,32(1):268- 274.

[17] Hanage W P, Fraser C, Spratt B G. Fuzzy species among recombinogenic bacteria [J]. Bmc. Biology, 2005,3:6.

[18] Caugant D A, Levin B R, Selander R K. Genetic Diversity and Temporal Variation in the Escherichia-Coli Population of a Human Host [J]. Genetics, 1981,98(3):467-490.

[19] Pinchua I V, Bressollier P, Sorokulova I B, et al. Amicoumacin antibiotic production and genetic diversity of Bacillus subtilis strains isolated from different habitats [J]. Research in Microbiology, 2002, 153(5):269-276.

[20] Kurmayer R, Christiansen G, Gumpenberger M, et al. Genetic identification of microcystin ecotypes in toxic cyanobacteria of the genus planktothrix [J]. Microbiology-Sgm, 2005,151(5):1525-1533.

[21] Christiansen G, Kurmayer R, Liu Q, et al. Transposons inactivate biosynthesis of the nonribosomal peptide microcystin in naturally occurring Planktothrix spp [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006,72(1):117-123.

[22] Mlouka A, Comte K, Castets A M, et al. The gas vesicle gene cluster fromand DNA rearrangements that lead to loss of cell buoyancy [J]. Journal of Bacteriology, 2004,186(8):2355- 2365.

[23] Kaebernick M, Neilan B A, Borner T, et al. Light and the transcriptional response of the microcystin biosynthesis gene cluster [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(8):3387-3392.

[24] Sevilla E, Martin-Luna B, Vela L, et al. Iron availability affectsD expression and microcystin-LR synthesis inPCC7806 [J]. Environmental Microbiology, 2008,10(10):2476-2483.

[25] Biand E, Escoffier N, Straub C, et al. Spatiotemporal changes in the genetic diversity of a bloom-forming Microcystis aeruginosa (cyanobacteria) population [J]. Isme Journal, 2009,3(4):419-429.

[26] Tanabe Y, Watanabe M M. Local expansion of a panmictic lineage of water bloom-forming cyanobacterium[J]. Plos One, 2011,6(2):e17085.

[27] Liu Y, Xu Y, Wang Z, et al. Dominance and succession ofgenotypes and morphotypes in Lake Taihu, a large and shallow freshwater lake in China [J]. Environmental Pollution, 2016,219:399- 408.

Genetic diversity and phylogenetic analysis ofin Poyang Lake based on MLST.

LIU Man-sen1, CAI Fang-fang2,3, WANG Yi-lang2,3, HUO Da2,3, YU Gong-liang2, LI Shou-chun1*, LI Ren-hui2*

(1.Colege of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330500, China；2.Key Laboralory of Algae Biology,Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)., 2019,39(7)：3081~3087

Using the multilocus sequence typing (MLST) based on seven housekeeping loci (Z,A,X,B,,A and), twentystrain isolated from Lake Poyang, the largest freshwater Lake in China, were examined to study their genetic diversity and phylogenetic relationship. The MLST revealed the 20 unique sequence types (STs) for these 20strains and their higher genetic diversity with H value as 0.986.The phylogenetic analysis based on the seven gene sequences showed that Microcystis strains were divided into five different groups, Phylogenetic tree based on the STs from our research and Japanese lakes revealed that our STs formed the independent branch, indicating that microcysts from different areas is relatively stable. So it can be clearly characterized by MLST.

water bloom；；MLST；genetic diversity；Poyang Lake；phylogeny

X524

A

1000-6923(2019)07-3081-07

柳滿森(1993-),男,漢族,甘肅蘭州人,江西師范大學碩士研究生,主要從事分子生態學方向的研究.發表論文1篇.

2018-12-17

國家自然科學基金(41561005);江西省自然科學基金(S2019ZRMSB0218)

* 責任作者, 李守淳, 教授, lisc@jxnu.edu.com;李仁輝, 研究員, reli@ihb.ac.com