無細胞百日咳疫苗時代百日咳桿菌黏附素蛋白缺失株的研究進展

高振軒，諶志筠，何秋水

(1.首都醫科大學基礎醫學院2015級五年制臨床醫學專業，北京 100069； 2.首都醫科大學基礎醫學院病原生物學系，北京 100069；3.芬蘭圖爾庫大學醫學微生物和免疫學系，圖爾庫 20520)

百日咳是由百日咳桿菌引起的一種急性呼吸道傳染病，人群普遍易感。百日咳以陣發性痙攣性咳嗽、咳嗽后嘔吐、雞鳴樣吼聲為典型臨床癥狀，可持續2～3個月，嬰幼兒患百日咳可導致嚴重后果，是我國法定乙類傳染病。百日咳疫苗的接種覆蓋率雖已很高，近年來，全球許多國家和地區的百日咳發病率卻有明顯上升的趨勢，局部地區甚至出現暴發流行，稱為“百日咳再現”[1-2]。除了臨床醫師診斷意識的提高、先進的實驗室方法[細菌培養、特異的百日咳桿菌核酸放大方法和血清百日咳毒素(pertussis toxin，PT)特異抗體檢測法等]的使用以外，疫苗接種后產生的免疫力的衰減和百日咳桿菌變異被認為是導致“百日咳再現”最重要的原因之一。大量研究證明，病原菌在不同的免疫接種策略下會出現不同程度的變異以適應選擇壓力，稱為“病原菌適應現象”[3-7]。近年來，在無細胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines，ACVs)普及率較高的國家中，百日咳桿菌黏附素蛋白(pertactin，Prn)缺失株的出現和增加，引起了全球極大關注[8]。我國ACVs的使用和普及較晚[3,9]，對Prn缺失株還缺乏較為系統的研究和認識。現就近年來國內外百日咳桿菌Prn缺失株的研究進展進行綜述。

1 百日咳疫苗的種類及特點

1.1 全球百日咳疫苗的種類和特點 百日咳疫苗主要分為全細胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines，WCVs)和ACVs兩種。WCVs的主要制作方法，是將百日咳桿菌全菌體滅活后，再與適當佐劑配伍。20世紀20年代，經臨床試驗證實有效性后，WCVs在全球范圍內被廣泛用于兒童初次免疫及加強免疫。在實施擴大免疫計劃的國家和地區，隨著接種覆蓋率的提高，百日咳發病率下降超過90%，一度得到了很好的控制[10]。但隨著時間的推移，WCVs的缺點逐漸顯現。比如，不同批次間的質量不易把控，接種后可能出現嚴重的全身反應，甚至出現腦炎、癲癇等，對嬰幼兒可能造成嚴重的后果甚至死亡[8,10]。為了降低接種疫苗后的不良反應發生率，自20世紀80年代，日本最先開始使用ACVs替代WCVs。ACVs的制作方法，主要是通過提純去掉一些能引起不良反應的無用的物質，保留具有免疫原性的百日咳桿菌抗原成分。目前，世界上使用的ACVs包括以下幾種。ACV1：僅含PT一種抗原。ACV2：含PT和絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)兩種抗原。ACV3：含PT、FHA和Prn三種抗原。ACV5：含PT、FHA、Prn、菌毛蛋白2(fimbriae，FIM2)和FIM3五種抗原。研究表明，含有Prn的ACVs比不含Prn的ACVs能誘導更強的免疫保護力，因此國際上使用的ACVs多含有Prn成分[11]。目前普遍使用的是ACV3。

1.2 我國ACVs的種類和特點 我國自20世紀60年代開始應用WCVs，2007年開始使用ACVs替代WCVs，并于2012年完成ACVs大面積覆蓋接種[9,12]。根據《中華人民共和國藥典》(三部)的要求，我國采用的各ACVs生產菌株以CMCC 58003(CS株)為主，采用共純化生產工藝，經過鹽析和離心收集PT、FHA，并作為有效組分制成ACVs原液，之后與破傷風類毒素和白喉類毒素合并并稀釋[13]。由于兩種抗原成分是共同提取的，因此缺乏分別定量的工作，且有可能含有其他百日咳桿菌來源的抗原成分[14]。

1.3 ACVs誘導的免疫應答特點及可能后果 雖然ACVs的接種在降低不良反應發生率的同時保留了疫苗的免疫原性，誘導單個抗原的特異性抗體的滴度較高，但大量研究證實，ACVs誘導的免疫應答僅針對少數抗原，不如WCVs廣泛；接種ACVs后的免疫保護力持久性相比WCVs進一步下降；ACVs的使用有可能導致疫苗所含抗原表達缺失的菌株的流行[8,15]。

2 “百日咳再現”及可能原因

20世紀50年代以來，百日咳疫苗的使用很大程度上降低了百日咳的發病率和死亡率。盡管如此，百日咳仍然是全球范圍內最流行的疫苗可預防性疾病之一。近年來，在很多發達國家和發展中國家，百日咳的發病率呈現明顯上升趨勢。英國、美國、澳大利亞、比利時等國家都有過疫情暴發的報道[2,16-18]。我國的百日咳疫苗接種覆蓋率從1983年的58%上升到了2012年的99%，1990年以來，我國百日咳報告發病率低于十萬分之一，防控措施取得了良好成效。但是，據我國國家衛生健康委員會統計，2015年、2016年及2017年全國百日咳報告發病數分別為6 658例、5 681例和10 390例，相比2014年以前(報告發病數在1 612～3 408例不等)，近三年的報告發病數明顯增多。截止到2018年底，已經報告百日咳22 057例[3,19]。

導致“百日咳再現”的原因，包括臨床醫師對疾病重視程度增加，診斷意識提高；先進的實驗室診斷技術的推廣應用，監測系統敏感性提高；接種疫苗后的免疫力衰減導致青少年及成人發病人群增加，成為嬰幼兒百日咳感染的重要傳染來源；百日咳桿菌變異影響疫苗接種的有效性等[20]。

3 Prn缺失株的發現及流行現狀

3.1 “Prn缺失株”的發現和流行 值得關注的是，近幾年出現的流行菌株中，有的不表達ACVs所包含的抗原成分，PT、Prn、FHA以及FIM等均可缺失[21]，而其中又以Prn缺失最為常見，這類菌株被稱為“Prn缺失株”。Prn缺失株于2003年在法國被首次發現，之后越來越多的Prn缺失株從各個國家的臨床流行菌株中被發現，甚至可能造成百日咳暴發流行[12]。根據2014年的一項加拿大九省菌株樣本調查研究顯示，最早在2011年收集的標本中，僅Ontario一個省出現Prn缺失株，而到2012年就已增加為兩個省，Ontario省的Prn缺失株占比更是達到了60%[22]。根據澳大利亞的一項研究報道，2008—2012年澳大利亞百日咳暴發時期收集的菌株中，Prn缺失株的比例從最初的5%迅速上升至78%[23]。2012年，在美國華盛頓州百日咳大暴發時期分離的菌株中，Prn缺失株所占比例超過了60%[12]，可見Prn缺失株在某些發達國家的流行趨勢已經十分嚴峻。

我國目前尚未發現Prn缺失株。但據近期的一篇國內的研究報道，2013—2014年收集的99個病例樣本中，出現了以prn2基因型為主的菌株，與ACVs抗原的基因型不同[7]。因此，是否會出現Prn缺失株，仍值得我國在百日咳預防工作中提高警惕，并加強對我國流行菌株分子生物學特征的監測，重視國家和地區以Prn缺失株為首的疫苗抗原缺失菌株的流行問題。

3.2 Prn缺失株的特點 Prn是一種外膜表面相關蛋白，屬于自轉運蛋白家族，具有較高的免疫原性，是很多ACVs的重要成分之一。Prn蛋白是由prn基因編碼的一個分子量為93 000的前體多肽，經過水解后獲得的一個分子量為63 000的蛋白，擁有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列三聯肽結構，可促進百日咳桿菌對宿主細胞的黏附作用，使之侵入到呼吸道黏膜纖毛上皮細胞和肺泡巨噬細胞，從而增強百日咳桿菌的侵襲力。同時，Prn還具有逃避中性粒細胞清除以及免疫調節的作用[8,24]。

根據美國、澳大利亞等國學者的大量臨床研究和實驗室數據顯示，與表達Prn的菌株相比，Prn缺失株對宿主的侵襲力和致病性并無明顯的差別。在6個月以下的嬰兒和動物模型中，Prn缺失株的毒力、致病性等與正常菌株相比無明顯差異，對引起常見的百日咳臨床癥狀(咳嗽、上呼吸道感染、百日咳嘔吐等)也無明顯影響[15,23,25-26]。在最近的一項研究中，將國際標準菌株Tohama Ⅰ型衍生菌株敲除編碼Prn的基因，所得到的Prn缺失株與原菌株相比，可刺激人體和小鼠的樹突狀細胞產生更多促炎性細胞因子，增加細胞的死亡。但從臨床分離出的 Prn缺失株卻并未觀察到這個現象[27]。因此可以推斷，百日咳桿菌中Prn的作用可以被其他毒力因子代償。但具體的分子機制尚不十分明確[8,15,26]。

3.3 Prn缺失株出現的可能的分子機制 Prn缺失株產生的可能的分子機制主要包括：prn啟動子倒位；IS481插入序列的插入；prn基因單核苷酸多態性導致引入終止密碼子，使蛋白翻譯提前終止；單核苷酸插入導致移碼突變；prn部分基因缺失，以及prn部分基因缺失后被另一片段取代[15,28]。其中，以IS481序列插入最為常見。原因可能是IS片段對于百日咳桿菌的基因復制和刪除有著極大的潛在影響，IS片段的插入可以導致偽基因的產生，從而“剔除”那些與感染侵襲等因素無關的蛋白，達到適應進化的目的[9,29]。

3.4prn表達缺失的分布特點 基因序列顯示，百日咳桿菌prn呈多態性，包括13個不同基因型，從prn1到prn13。國內外用來生產疫苗的菌株表達prn1或prn7，但大多數臨床分離株表達prn2[30-31]。導致Prn表達缺失的基因突變可在百日咳桿菌各個譜系獨立產生。在美國，一項對1935—2012年百日咳流行菌株進行脈沖場凝膠電泳分型的調查顯示，與Prn表達菌株中占領絕對優勢的CDC013菌株不同，CDC002和CDC237菌株占據著Prn缺陷菌株的統治地位，占比達到55%，CDC013菌株卻只占5%[32-33]；而另一項調查證明，在日本傳播的Prn缺失株是克隆擴增的結果，與在法國發現的Prn缺失株的分子機制有明顯不同[34]。在日本發現的Prn缺失菌株多為prn1型，法國[34]、美國[33]則多為prn2型。有研究顯示，部分日本Prn缺失株的基因突變類型在世界范圍內沒有檢測到近源的祖先菌株，表明這一譜系的Prn缺失菌株僅在日本原發出現[15,23,34-36]。另外，一些地區的流行菌株基因型會呈現出與國家流行菌株有所不同的現象，提示不同地區的百日咳桿菌基因型的變化導致的Prn缺失株具有地區特異性[36]。這也可能是百日咳疫情在某些地區出現暴發的原因。

3.5 Prn缺失株出現的原因 相似的人群選擇壓力，特別是疫苗免疫策略則會使Prn缺陷菌株固定在特定人群中，并造成暴發和流行。美國、澳大利亞和法國等國的研究發現，Prn缺失株暴發流行的現象與普及ACVs接種的時間和所含抗原成分關系密切(表1)。在澳大利亞的一項研究中，研究者用同等劑量的Prn表達菌株和Prn缺失株同時感染未免疫和ACVs免疫后的幼年小鼠。在未免疫的小鼠中，Prn表達菌株占據了絕對地位，而經過ACVs免疫后的小鼠中，Prn缺失株卻占據了統治地位[37]。根據歐盟一項比較1998—2012年不同國家臨床分離株的研究，各個采取ACVs免疫策略的國家中，只有丹麥未發現Prn缺失株。值得注意的是，丹麥的ACVs中僅含有PT一種成分，因此Prn缺失株很可能在這種免疫人群中沒有選擇優勢[15]。在日本，Prn缺失株自1997年開始出現，2005—2007年占臨床分離菌株的比例達到41%，2008—2010年為35%。之后，Prn缺失株所占比例開始逐年下降，2011—2013年為25%，2014—2016年為8%。值得注意的是，自2012年起，日本開始使用不包含Prn的ACVs[38]。根據美國的一項研究，Prn缺失株與Prn表達株對于臨床應用的抗生素的敏感性沒有顯著差異，因此可以基本排除臨床治療方案對于Prn缺失株產生的影響[39]。所以，Prn缺失株的出現，可能是含有Prn成分的ACVs造成的免疫環境改變，對菌株產生新的選擇壓力的結果。

綜上所述，Prn缺失株的流行和暴發實際上是菌株自身的變異和宿主人群免疫水平共同作用所產生的自然選擇的結果[11,40]。

表1 部分國家疫苗接種情況及Prn缺失株的發現和流行情況

*ACV1=PT； ACV2=PT+FHA； ACV3=PT+FHA+Prn； ACV5=PT+FHA+Prn+FIM2+FIM3；-尚未發現Prn缺失株； ACV1～5：含1～5種抗原的無細胞百日咳疫苗； Prn：黏附素蛋白； PT：百日咳毒素； FHA：絲狀血凝素； FIM：菌毛蛋白

3.6 Prn缺失合并其他基因變異株的出現 目前，已經被發現并記錄17種由于PT編碼基因的啟動子區的點突變所導致的百日咳桿菌新的基因型。在對2005—2016年日本流行菌株的研究中，與ptxP3密切相關的多位點串聯重復序列數變化分型中的MT27型逐漸處于統治地位，且在其中已經發現了Prn缺失株[34,46]。與此同時，在歐盟的一項調查研究中，也發現了Prn缺失株同時包括ptxP3基因型。ptxP3譜系于20世紀80年代后期首次發現，相較于ptxP1譜系能產生更多PT，并且近十幾年來在使用ACVs的國家中逐漸占據統治地位[12,15]。因此，這種同時具有ptxP3基因型和Prn缺失現象的菌株，也許會更加適合ACVs免疫背景下的國家和地區，可能是將來應該重點監測和研究的菌株。

除此以外，近年的研究報告中，各國學者們也發現了PT合并Prn共同缺失的菌株。有研究證明，存在PT缺失的菌株依舊能侵入上皮細胞造成巨噬細胞凋亡，并且可產生類百日咳現象。此外，由于目前百日咳血清學診斷主要是檢測特異的PT抗體，因此含有PT缺失的菌株很容易引起血清學檢驗的漏報現象，為臨床確診工作帶來麻煩[8,26,35]。所以這種Prn缺失合并其他基因變異的菌株也應該在未來引起人們的關注和重視。

4 結 語

相對于WCVs接種后誘導的廣泛免疫應答，ACVs接種后僅誘導單抗原免疫作用增加。而Prn缺失株的特點使其更容易逃避宿主免疫，擁有巨大的自然選擇優勢，因此這種菌株的流行大大降低了ACVs的疫苗效力，造成的百日咳流行和暴發也成為了ACVs時期被廣泛關注的問題。國際上還沒有建立Prn缺失株的標準菌株，因此對這一領域的探究還有極大的發展空間[26,36]。我國正處于ACVs廣泛應用的初期，面對Prn缺失株為代表的ACVs抗原缺失菌株帶來的挑戰，必須保持足夠的警惕。盡管目前國際上對于Prn缺失株的解決辦法還不是很多，但是加強流行菌株的監測，建立更加完備的百日咳診斷體系，完善疫苗制作方式，更新疫苗菌株，以及繼續提升疫苗覆蓋率等舉措，是目前國際上達成共識的應對措施和有效辦法。