長鏈非編碼RNA LINC00662通過調控miR-409-5p對宮頸癌細胞增殖和侵襲的影響

王君蓮 宋曉暉 吳波 柴建蘭

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢市婦幼保健院）婦產科（武漢430071）

宮頸癌是最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，近年來發病呈年輕化的趨勢，嚴重威脅女性生殖健康［1］。研究宮頸癌細胞中的關鍵分子的調控機制，對深入了解宮頸癌的發生、發展過程及靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類超過200個核苷酸的長鏈非編碼RNA，大量研究證實LncRNA與多種腫瘤的發生、發展顯著相關［2］。LncRNA在宮頸癌中的研究尚處于初級階段，有望成為宮頸癌診斷和治療的重要靶點［3］。LINC00662是一種新發現的LncRNA，參與調控口腔鱗狀細胞癌、肺癌、胃癌等腫瘤細胞的生物學功能［4-6］。LINC00662在宮頸癌中的表達情況和作用機制研究未見報道。本研究通過檢測宮頸癌組織和細胞系中LINC00662表達量，分析LINC00662在宮頸癌發生、發展中的作用及機制，旨在為宮頸癌的分子靶向治療提供理論基礎和實驗依據。

1 對象和方法

1.1研究對象

1.1.1組織樣本收集2016年11月至2018年3月在我院行外科手術的患者被切除的宮頸癌組織和配對的癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm）39例，所有患者術前未進行放、化療治療。采集的樣本于液氮保存，均被病理組織學診斷為宮頸癌。本研究經本院醫學倫理委員會同意，所有患者均簽署了知情同意書。

1.1.2細胞系與試劑人宮頸癌細胞系（Hela、C33A、HCC94、SiHa）和人正常宮頸上皮細胞系H8均購于中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。載有LINC00662的質粒和陰性對照質粒購自上海吉瑪公司。Lipofectamine 3000轉染試劑、DMEM/F12培養基、RPMI 1640培養基和胎牛血清（FBS）購自美國Life Technologies公司。CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技公司。qPCR相關試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。Matrigel基質膠購自美國BD公司。Transwell小室購自美國 Corning公司。一抗 β-Tubulin、DIRAS3、Cyclin D1、Cyclin A2、ZEB-1和ZEB-2抗體均購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染Hela、HCC94、SiHa細胞系傳代培養于RPMI 1640培養基，C33A、H8細胞系傳代培養于DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。在6孔培養板中接種對數生長期的HCC94細胞，實驗分為對照組（轉染陰性對照質粒）和觀察組（轉染載有LINC00662的質粒），依據Lipofectamine 3000試劑盒說明書進行轉染。

1.2.2生物信息學技術預測LINC00662的靶基因采用DIANA TOOLS軟件預測LINC00662可靶向結合的微小RNA（miRNA）。采用TargetScan Release 3.1軟件預測對應的miRNA可靶向結合的基因。

1.2.3熒光實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）抽提組織和細胞總RNA依據PrimeScript逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA行qPCR檢測。LINC00662上游引物為 5′-AGGACAGAATCTCCGTGGAC-3′，下游引 物 為 5′-TTGATCTTTTAGATTTCTGTCACACTC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物為 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-409-5p上游引物為 5′-GGGAGGTTACCCGAGCAACT-3′，下游引物為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；DIRAS3上游引物為 5′-GATTACCGCGTCGTGGTAGTC-3′，下游引物為 5′-TCAATGGTCGGCAGGTACTCA-3′。以GAPDH為內參檢測LINC00662和DIRAS3 mRNA的相對表達量，以U6為內參檢測miR-409-5p的相對表達量。

1.2.4蛋白質印跡法（Western Blot）轉染操作48 h后，收集兩組并提取細胞總蛋白。每組上樣50 μg蛋白量至聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后采用5%脫脂牛奶封閉，分別加入一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h。在凝膠成像系統發光顯影。

1.2.5CCK-8檢測HCC94細胞增殖能力轉染操作48 h后，收集并調整細胞密度至2×104個/mL。以每孔200 μL接種至96孔板，分別在接種后第1、2、3、4、5 d，分別加入 15 μL CCK-8溶液，繼續培養。4 h后吸去培養基，每孔加150 μL二甲基亞砜，采用酶聯儀檢測490 nm波長處每孔的吸光度（A）值。

1.2.6Transwell實驗檢測HCC94細胞侵襲能力將Matrigel基質膠均勻鋪在Transwell上室，培養箱內凝固。下室加600 μL新鮮培養基。轉染操作48 h后，重懸細胞并調整密度至2×105個/mL。在上室內加細胞懸液200 μL/孔，繼續培養24 h。取出上室，甲醇固定10 min，結晶紫溶液染色10 min，棉簽擦去未穿過濾膜細胞。光學顯微鏡下隨機選4個視野計細胞總數并取平均數。

1.3統計學方法采用統計學軟件SPSS 20.0進行統計分析。實驗計量數據均以均數±標準差表示，組間比較采用兩樣本獨立t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1LINC00662在宮頸癌組織中的差異表達qPCR檢測結果顯示，LINC00662在癌旁組織中的相對表達量是宮頸癌組織的0.32倍，差異有統計學意義（P ＜0.01，圖1）。

圖1 LINC00662在宮頸癌組織和配對的癌旁組織中的表達Fig.1 The expression of LINC00662 in cervical cancer and para-carcinoma tissues

2.2LINC00662在宮頸癌細胞系中的差異表達qPCR檢測結果顯示，與正常宮頸上皮細胞系相比，LINC00662在宮頸癌細胞系中的表達均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 LINC00662在宮頸癌細胞系和正常宮頸上皮細胞中的表達Fig.2 The expression of LINC00662 in normal cervical epithelial cell and cervical cancer cell lines

2.3生物信息學技術預測LINC00662靶向結合的miRNA及靶基因本研究采用DIANA TOOLS和TargetScan Release 3.1軟件預測分析（圖3），LINC00662可靶向結合miR-409-5p，miR-409-5p可靶向結合DIRAS3 mRNA。

圖3 LINC00662靶向結合miR-409-5p的序列區域，miR-409-5p靶向結合DIRAS3 mRNA的序列區域Fig.3 The complementary binding sequence of LINC00662 and miR-409-5p,the complementary binding sequence of miR-409-5p and DIRAS3 mRNA

2.4LINC00662、miR-409-5p和DIRAS3 mRNA在兩組細胞中的表達qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，觀察組HCC94細胞LINC00662的表達明顯增加（P＜0.01），miR-409-5p的表達明顯減少（P＜0.01），DIRAS3 mRNA的表達明顯增加，提示高表達LINC00662可增加miR-409-5p的表達，降低DIRAS3 mRNA的表達。

2.5高表達LINC00662的細胞中DIRAS3蛋白的表達Western Blot檢測結果顯示（圖4），高表達LINC00662后，DIRAS3蛋白表達明顯增加，細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和Cyclin A2表達明顯減少，細胞轉移相關蛋白ZEB-1和ZEB-2表達明顯減少。

圖4 高表達LINC00662對HCC94細胞DIRAS3蛋白及相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of upregulated LINC00662 on the expression of DIRAS3 protein and related proteins in HCC94 cells

2.6高表達LINC00662可抑制細胞增殖能力CCK-8法檢測結果顯示（圖5），接種后第3天開始，觀察組HCC94細胞吸光度顯著低于對照組HCC94細胞（P＜0.05），表明高表達LINC00662可抑制HCC94細胞增殖能力。

圖5 高表達LINC00662表達對HCC94細胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of upregulated LINC00662 on the proliferation of HCC94 cells

2.7 高表達LINC00662可抑制細胞侵襲能力Transwell侵襲實驗結果顯示（圖6），對照組穿膜細胞數明顯高于觀察組穿膜細胞數（P＜0.01），提示高表達LINC00662可抑制HCC94細胞的侵襲能力。

圖6 高表達LINC00662表達對HCC94細胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of upregulated LINC00662 on the invasion ability of HCC94 cells

3 討論

宮頸癌的發生發展是一個多基因參與的復雜生物學過程，要求從多種分子水平對其機制進行研究［7］。近年來隨著對LncRNA的研究的越來越多，LncRNA的功能研究對于探索腫瘤的發生機理和尋求腫瘤治療靶點具有重要的臨床意義［8］。LIU等［2］發現LncRNA SNHG1在宮頸癌組織中表達明顯上調，可促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲。YANG等［9］的研究結果發現，宮頸癌中LncRNA GAS5表達明顯下調，高表達LncRNA GAS5可通過干擾miR-196a和miR-205的表達，抑制宮頸癌的進展。既往的研究表明，LINC00662在口腔鱗狀細胞癌、肺癌、胃癌等［4-6］多種腫瘤具有明顯的調控作用，表明LINC00662參與腫瘤的發生、發展過程。關于LINC00662在宮頸癌中的功能尚不清楚。

本研究結果顯示，相較癌旁組織和正常宮頸上皮細胞系，LINC00662在宮頸癌組織和細胞系中的表達均明顯減少，表明LINC00662可能在宮頸癌的發生發展中具有一定的調控作用。LncRNA通過“海綿作用”吸附下游miRNA，抑制miRNA表達，是lncRNA發揮調控作用的重要機制之一［10］。本研究采用DIANA TOOLS軟件分析顯示，LINC00662可靶向結合 miR-409-5p。YU 等［11］研究發現，miR-409-5p在乳腺癌組織和細胞系中表達顯著增加，低表達miR-409-5p具有抑制乳腺癌進展的作用，發揮明顯的癌基因作用。本研究結果顯示，過表達LINC00662后，miR-409-5p的表達明顯減少，表明LINC00662可通過吸附miR-409-5p抑制其表達。微小RNA（miRNA）主要通過結合下游基因mRNA，干擾mRNA翻譯或者直接導致其降解，從而發揮抑制基因表達的作用。采用TargetScan Release 3.1軟件分析顯示，miR-409-5p可靶向結合 DIRAS家族 GTP酶 3（DIRAS family GTPase 3，DIRAS3）基因。DIRAS3基因定位為1號染色體lp31區域，由1個內含子和2個外顯子組成，屬于Ras超家族成員［12］。DIRAS3在人體組織內廣泛表達，在多種腫瘤組織中表達減少［13］。DIRAS3低表達與腫瘤發生、發展密切，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用［14］。本研究結果顯示，miR-409-5p的表達明顯減少后，DIRAS3 mRNA的表達明顯增加，提示miR-409-5p可能具有抑制DIRAS3表達的作用。DIRAS3蛋白具有抑制腫瘤增殖和轉移的作用。本研究通過Western Blot實驗發現，DIRAS3蛋白表達增加后，細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和Cyclin A2表達明顯減少，細胞轉移相關蛋白ZEB-1和ZEB-2表達明顯減少，均提示宮頸癌細胞的增殖和轉移能力下降。為進一步研究LINC00662在宮頸癌中的生物學功能，本研究通過CCK-8實驗和Transwell侵襲實驗發現，在宮頸癌HCC94細胞中高表達LINC00662后，HCC94細胞增殖能力和侵襲能力降低，說明LINC00662可能通過降低miR-409-5p、促進DIRAS3基因的表達，參與調控宮頸癌的發生、發展。

本研究首次發現LINC00662在宮頸癌組織和細胞系中表達量明顯減少。宮頸癌細胞中，高表達LINC00662可明顯抑制其下游靶點miR-409-5p的表達，從而促進DIRAS3基因的表達，抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力。高表達LINC00662在宮頸癌發生、發展過程中發揮重要的調控作用，可能成為宮頸癌治療的潛在靶點。