非連續密度梯度離心法不同離心力對精子DNA完整性的影響*

譚秀飛 張洪麟 廉征宇 孫德印 李 末

大連醫科大學附屬大連市婦產醫院，大連市婦幼保健院生殖中心（遼寧大連 116000）

近年來，隨著輔助生殖技術的發展，越來越多的不孕不育癥患者有了生育的希望，據統計男方因素導致的不孕不育約占總體的40%～50%，但傳統的精液分析并不能充分解釋男性生育力相關問題，因此有部分學者提出需要更多的參數來彌補傳統精液分析的不足，其中精子DNA完整性的定量分析得到了多專家的認可，已有研究指出精子DNA碎片化指數 （DNA fragmentation index，DFI）與臨床妊娠率、活產率等呈負相關性[1]，同時有人指出精子DFI易受到外界因素及自身疾病、生活習慣等的干擾，特別是精液的優化處理作為輔助生殖技術中必不可缺的一環，目前學界對DFI的影響尚缺乏統一的意見[2,3]。

針對不育癥患者精液優化處理的研究已成為臨床研究工作的重點之一，最新發布的《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》[4]中精液優化處理方法包括了簡單洗滌法、非連續密度梯度離心法以及直接上游法，其中非連續密度梯度離心法因其回收率高結果穩定，操作更易標準化，被更廣泛的應用于目前的臨床IVF、ICSI中，離心力作為梯度離心最重要的參數，對DFI的影響尚不十分明確。本次研究的目的是通過對比不同離心力下的傳統精液參數以及DFI，明確離心力與DFI、精液參數之間的關系，得到最適合臨床工作的離心參數。

資料與方法

一、研究對象

搜集2016年6月至2017年6月在大連醫科大學附屬大連市婦產醫院生殖中心接受人工授精治療的100例不育癥男性患者精液樣本，所有患者均符合以下條件：（1）精液體積≥4mL；（2）根據 WHO 第 5版標準精液分析為正常；（3）不育癥考慮女性因素所致，排除不明原因不育及明確的男方因素；（4）排除梅毒、艾滋病、丙肝、淋病、尖銳濕疣等傳染性疾病。所有患者均簽署知情同意書，研究經大連醫科大學附屬大連市婦產醫院倫理委員會同意。

二、儀器與試劑

精液分析使用清華同方精子分析儀CASAS-QHIII；巴氏染色液購自深圳華康生物醫學工程有限公司；精子DNA碎片檢測試劑盒購自深圳博銳德生物科技有限公司；梯度離心培養液使用Origio公司的Pure-CeptionTM梯度離心培養液（40%、80%）；精子培養液使用Origio公司的Quinn'sTM精子培養液。

三、方法

（一）樣本采集

100例患者采集前禁欲2～7d，手淫法采集精液樣本于無菌無毒的廣口容器內，室溫下搖勻器充分混勻液化后，由經過國家男性健康重點實驗室培訓的2名實驗員按照WHO第5版標準分別進行檢測，嚴格質控。

（二）分組

100例樣本充分混勻，取4mL均分為4份，1mL作為空白對照組，其余3mL參考WHO最新推薦精液優化處理，分別使用 300×g、400×g、500×g進行非連續密度梯度離心，作為3個處理組 （為300×g組、400×g組、500×g組）。

（三）非連續密度梯度離心

在離心管中制備密度梯度液，下層為1mL 80%PureCeption梯度離心培養液、上層為1mL 40%Pure-Ception梯度離心培養液，靜置待出現清晰分離界面，將液化的精液充分混勻，取1mL液化精液覆蓋于上層培養液液面上方， 以 300×g、400×g、500×g離心 20min 后棄上清液，5mL精子培養液重懸精子沉淀團，輕輕吹打然后以200×g離心5min，棄上清液，共洗滌兩次，用0.5mL培養液重懸精子沉淀團后進行檢測。

（四）精液常規分析

標準依據 《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版，使用計算機輔助精液分析系統(computer aided sperm analysis，CASA)進行分析，包括精液PH、精子總數、濃度、活動率（PR+NP）、前向運動精子百分率（PR）。

（五）形態學分析

標準依據 《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版，使用巴氏染色法染色，每張玻片讀取至少200個精子，統計正常形態率。

（六）DNA完整性檢測

染色質擴散法 （sperm chromatin dispersion,SCD）采用精子DNA碎片檢測試劑盒（深圳博銳德生物科技有限公司），將精液與瓊脂糖混合固定于載玻片，溶解細胞去除核蛋白，染色劑染色，最后用顯微鏡觀察結果。根據精子DNA產生的光暈進行評估，正常的精子DNA產生擴散的光暈，而損傷的精子DNA則不產生或產生很小的光暈，結果判斷標準：（1）大光暈：單側光暈厚度大于精子頭部最小直徑；（2）中光暈：介于大光暈和小光暈之間；（3）小光暈：單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3；（4）精子頭部僅產生較少的光暈或者無光暈，小光暈和無光暈精子為存在DNA碎片的精子，計數至少400個精子。精子DFI=［（小光暈精子數+無光暈的精子數+退化的精子數）/400］×100%。

（七）統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據的統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，處理前后各組精液濃度、活動率、形態以及DNA碎片率等數據比較采用t檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

100名志愿者的精液樣本基本參數見表1。

由表2可見，3個處理組在精子濃度方面均較對照組有有所下降，在活力方面均較對照組有明顯提高，而在前向運動精子百分率、精子正常形態率方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），另外，以上幾方面在3個處理組間進行對比差異均無統計學意義。300×g和400×g組的精子DFI均明顯低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），而本次實驗的500×g組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，比較前向運動精子回收率在3個處理組之間差異并無統計學意義。

表1 100名志愿者精液基本參數

表2 不同處理方案后精液質量比較（x±s）

討 論

精子的DNA可分為兩個部分，即位于頭部的精子核DNA以及位于精子中部的線粒體DNA（mDNA），其本質都是一種被魚精蛋白緊密包裹著的高度折疊結構，幾乎包含了父系傳遞給子代的所有遺傳物質，其結構的完整性直接影響到受精卵的形成甚至子代的生長發育，另一方面，精子DNA的完整性易受到多種因素影響，其中包括過氧化損傷、魚精蛋白的缺失或突變、熱損傷以及生殖腺毒性物質損傷等[3]，因此如何在處理過程中獲得更多DNA完整的精子已逐漸成為國內外生殖中心的研究熱點。

關于精子DNA完整性的檢測方法目前國內外的標準尚不完全統一，根據檢測的原理不同大致可分為直接法和間接法，其中直接法主要應用探針對目標DNA進行直接檢測，間接法則是利用斷裂DNA的理化特性通過檢測中間產物進而判斷DNA的完整程度，目前臨床上最常見的檢測方法有原位末端標記試驗（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）、精子染色質結構分析試驗（sperm chromatin structure assay，SCSA）、染色質擴散試驗（sperm chromatin dispersion，SCD）等。 本次研究我們選擇了SCD法，相關的臨床資料已證實SCD法對精子DNA的完整性有較好的預測價值，與其它檢測手段的結果存在一致性[5]，并且較其它檢測方法SCD法檢測技術更成熟，操作更便捷有利于臨床應用。

本次研究中離心力300×g與400×g組的精子DFI經過梯度離心處理后均較對照組有明顯改善，這與鄭毅春等[6]的研究結果一致，證實了梯度離心處理在優化傳統精液參數的同時能夠改善精子DNA的完整性，這一切可能得益于雙層梯度離心培養液對精子的懸浮以及緩沖作用，也有可能是由于優化處理過程中去除了精漿中對精子有害的炎癥因子，但仍有部分學者對此持否定的意見，張清健等[7]既往研究對比了離心力300×g與1200×g對精液的濃度、活力、形態、DFI等方面的影響，結果發現無統計學差異，Stevanato等[8]經過研究后認為離心對精子DNA完整性的改變并不是單向的，甚至有部分參數比處理前更差，這與本實驗中離心力500×g組相似，處理后離心力500×g組DFI明顯高于其它處理組，我們認為可能是由于梯度離心過程中額外產生的氧化活性物質（reactive oxygen species，ROS）包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧基、過氧羥自由基等引起了DNA的損傷，也有人認為離心過程中較高離心力產生的橫向剪切力破壞了精子的正常結構從而導致了DNA的損傷，這可能需要未來我們搜集更多的資料來探討。

本實驗中包括前向運動百分比以及精子存活率在內的傳統精液參數均在處理后較對照組有所提高，這與鄧順美等[9]的結論一致，他們通過離心處理臨床弱精子癥的樣本統計后得出結論認為非連續密度梯度法制備精子能顯著提高弱精子癥患者精子總活力、前向運動精子百分率、正常形態精子百分比和精子DNA完整性，符合我們的預期，但本次研究中正常形態精子百分比在處理前后并未表現出明顯差異，甚至在500×g組較處理前有降低的趨勢，這可能是由于較高離心力引起了精子形態學的改變，關于是否影響精子的受精潛能可能需要未來做進一步的研究。

盡管國內外已有許多研究報道在輔助生殖技術過程中精子DNA的完整性與臨床成胚率、著床率、活產率以及不良妊娠率等均有密切關系[1,12-14]，最新的歐美泌尿外科以及生殖醫學學會指南中都已經將精子DNA完整性列為男性不育的檢測指標之一[10,11]，但是關于精子DNA完整性對妊娠的影響目前國際上尚存爭議，學者Zidijrah等[12]研究后發現在復發性流產的夫妻中男性精子的DFI比正常夫妻明顯升高，說明精子DFI可能是復發性流產的相關因素之一，馮娜等[13]則通過統計IVF患者的妊娠結局發現高DFI可以明顯降低輔助生殖技術的臨床妊娠率及活產率，這與國外Jin等[1]的研究結論類似。但是仍有很多學者持不同觀點，近期Zhang等[14]總結了既往20個大型研究得出結論認為精子DNA完整性對于輔助生殖技術的指導意義目前仍不能明確，需要更多的數據來佐證。

綜上所述，離心力在非連續密度梯度法制備精子過程中發揮著重要作用，適當的離心力能夠有效的優化精液，但過高的離心力可能會對精子造成不可逆的損傷，因此臨床輔助生殖工作過程中我們應盡量避免高離心力對精子的損害，采用適當的離心力不僅能富集精子提高精子活力，還能得到更多DNA完整的精子，有效降低了精子DFI，為后續實施人類輔助生殖技術保駕護航。