拉坦前列素對人表皮黑素細胞增殖與黑素合成的影響及機制探討

蔡羽恬 郭寧寧 郭遠 王璐媛 劉莉萍 李遇梅

江蘇大學附屬醫院皮膚科，鎮江212001

拉坦前列素（latanoprost）是一種前列腺素F2α（PGF2α）類似物，被用于治療眼內壓升高性疾病，包括高眼壓和開角型青光眼[1]。根據拉坦前列素使虹膜及眼周皮膚色素沉著增加的藥物不良反應，其對于白癜風等色素脫失性疾病的治療前景得以探討[2]。數項初步臨床研究發現，外用拉坦前列素對局限型、穩定期白癜風皮損效果顯著，且其效能至少與一線用藥（如0.1%他克莫司）相當[3-6]。為進一步探討拉坦前列素對表皮黑素細胞的作用，我們將拉坦前列素作用于體外培養的正常人黑素細胞，研究其對黑素細胞增殖及黑素合成的作用。

材料與方法

1.細胞來源：從青少年包皮中分離人表皮黑素細胞后原代培養、傳代，至第3 ～5代時使用。本實驗所用包皮全部來源于泌尿外科包皮環切術后的遺棄標本，供者年齡＜25歲，均無白癜風病史或家族史。本研究經江蘇大學附屬醫院倫理委員會批準（批件號：SWYXLL20170901），取材前均獲得供者知情同意。

2.主要實驗試劑：拉坦前列素粉末（純度99.7%，美國TargetMol 公司），以二甲基亞砜（美國Sigma公司）配制成10-2mol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱儲存，實驗前將其配制成各實驗濃度。分散酶（美國Sigma 公司），254 培養基和人黑素細胞生長添加物（HMGS）（美國Gibco 公司），CCK8 試劑盒（日本DOJINDO公司），Triton X-100（合肥博美生物科技有限公司），Masson-Fontana 黑素染色液（美國Solarbio公司），逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（日本Takara 公司），小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）、β肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Millipore公司），MITF、TYR、TYRP1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.黑素細胞原代分離與培養：取包皮環切術后組織，用含青鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，剪除皮下及部分真皮組織，剪成5 mm×5 mm大小，置于0.3%分散酶中消化8 ～12 h。取出組織塊，用PBS 沖洗后分離表真皮。將表皮剪碎，加入0.25%胰酶-乙二胺四乙酸，消化10 min，用膠頭滴管輕吹懸液后，4 ℃、1 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min，重懸、計數，以5×105個/ml密度接種于直徑6 cm 培養皿中。將細胞置于37 ℃，5%CO2培養箱中，隔天換液，待細胞生長至70%～80%皿底面積時，加入0.025%胰酶-乙二胺四乙酸消化傳代。選用3 ～5代黑素細胞進行后續實驗。利用黑素的嗜銀性，將Masson-Fontana 銀染色后可見褐黑色黑素的細胞鑒定為黑素細胞。

4.實驗分組與處理：前期預實驗已排除藥物載基對細胞的影響，并已測拉坦前列素對人表皮黑素細胞的IC50值為8.8×10-5mol/L，且10-8mol/L及更小濃度的拉坦前列素處理黑素細胞后，細胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成及相關基因mRNA和蛋白的表達與對照組相比差異無統計學意義。因此，將拉坦前列素加入254培養基配制成10-5、10-6、10-7mol/L分別處理培養的人表皮黑素細胞，對照組僅用不加拉坦前列素的培養基處理。

5.CCK8 法檢測黑素細胞增殖：將黑素細胞以1 × 104個/孔接種 96 孔板，每孔 100 μl。按上述方法分組給藥處理48 h，每濃度組設3個復孔。每孔加入10 μl CCK8溶液，在培養箱中孵育4 h，用酶標儀測定450 nm 處吸光度（A值）。細胞增殖水平以A450表示。

6.多巴比色法檢測酪氨酸酶活性：將黑素細胞以1 × 104個/孔接種96孔板，每孔100 μl。按上述方法分組給藥處理48 h，每濃度組設立3個復孔。PBS清洗 3 遍后，每孔加入 1%TritonX-100 溶液 90 μl。將培養板于-80 ℃冰箱中放置30 min，置于室溫融化。配制0.1%左旋多巴溶液，每孔加入100 μl。于培養箱放置2 h，用酶標儀測定490 nm 處A值。酪氨酸酶活性以A490表示。

7.NaOH 溶解法檢測黑素含量：將黑素細胞以1×105個/皿的濃度接種入直徑6 cm 培養皿，按上述方法分組給藥處理48 h 后每皿加1 mol/L NaOH溶液1 ml，置于培養箱中溶解黑素12 h。將皿中的液體轉移至96 孔板，各濃度組均設3 個復孔，每孔加 100 μl 裂解液。用酶標儀測定 405 nm 處A值。黑素含量以（藥物處理組A405/對照組A405）×100%表示。

8.Western印跡檢測黑素細胞定向發育及黑素合成相關蛋白MITF、TYR、TYRP1 的表達：將黑素細胞以1×105個/皿種入直徑6 cm培養皿。按上述方法分組給藥處理48 h 后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂 解 液 冰 浴 0.5 h 提 取細胞總蛋白。4 ℃、12 000×g離心10 min 后取上清液，用BCA 法進行蛋白濃度測定后將所提取蛋白進行熱變性處理。行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉，分別加入1∶1 000 稀釋的 MITF、TYR、TYRP1 和 β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜后加入1∶2 000 稀釋的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜。加入ECL 超敏顯影劑顯色曝光，用ImageJ軟件對條帶進行灰度分析，將目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值進行歸一化處理，比較各組蛋白的表達量。

9.Masson-Fontana 黑素染色：將黑素細胞以5×104個/孔濃度種入6孔板，按上述方法分組給藥處理48 h 后每孔加4%多聚甲醛溶液1 ml，室溫固定20 min。用蒸餾水輕吹洗滌后靜置3 min，重復3遍。用Masson-Fontana黑素染色液按照試劑說明對黑素細胞進行染色后，鏡下觀察。

10.熒光定量 PCR 檢測 MITF、TYR 和 TYRP1 mRNA 的表達：黑素細胞以 5 × 104個/孔種入 6 孔板，按上述方法分組處理48 h后用TRIzol法提取細胞總RNA，參照TaKaRa 試劑盒說明書逆轉錄制備cDNA 并進行擴增。引物序列見表1。用MxPro QPCR 軟件獲得代表熒光強度的Ct 值，Ct 目的基因-Ct內參基因 = ΔCt，ΔCt給藥組樣本-ΔCt對照樣本 = ΔΔCt，用2-ΔΔCt代表mRNA的相對表達量。

11.統計分析：定量資料用單因素方差分析法（ANOVA）和LSD-t檢驗法分別進行多組間比較及組間兩兩多重比較，P＜0.05 認為差異有統計學意義，每項實驗重復3次。采用SPSS 23.0軟件分析數據，GraphPad Prism 6.0繪制統計圖。

結 果

1.拉坦前列素對黑素細胞增殖的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間細胞增殖水平差異有統計學意義（P=0.024）。10-6、10-5mol/L拉坦前列素組均顯著高于對照組（均P＜0.05），但這兩組間差異無統計學意義（t= 0.164，P=0.873）。10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組差異無統計學意義（P=0.23）。見表2。

2.拉坦前列素對酪氨酸酶活性的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間酪氨酸酶活性各不相同（P=0.002），10-6、10-5mol/L拉坦前列素組均顯著高于對照組（P＜0.05），這兩組間差異無統計學意義（t=2.200，P=0.059）。10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組差異無統計學意義（P=0.063）。見表2。

表1 熒光定量PCR法所用引物序列（5′-3′）

表2 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細胞增殖、酪氨酸酶活性、黑素合成的影響

3.拉坦前列素對黑素含量的影響：10-5、10-6、10-7mol/L 拉坦前列素組及對照組間黑素合成量各不相同（P=0.000 3），10-6、10-5mol/L 拉坦前列素組間差異無統計學意義（t=1.264，P=0.242），但這兩組均顯著高于對照組（P＜ 0.01）。而10-7mol/L 拉坦前列素組與對照組相比差異無統計學意義（P=0.077）。見表2。

Masson-Fontana 染色顯示，各濃度拉坦前列素組黑素細胞樹突上的黑素顆粒均較對照組數量更多、顏色更深，且隨拉坦前列素濃度的升高，黑素顆粒的顯色從淡棕色加深至黑褐色。見圖1。

4.拉坦前列素對黑素細胞關鍵基因mRNA 表達的影響：見圖2。各組MITF、TYR、TYRP1 mRNA表達量差異均有統計學意義（F值分別為112.594、99.051、342.301，均P＜ 0.01）。10-7mol/L拉坦前列素組MITF mRNA 的表達顯著高于對照組（t=3.905，P＜ 0.01）、低于10-6mol/L 拉坦前列素組（t=5.710，P＜ 0.01），10-6mol/L組顯著低于10-5mol/L拉坦前列素組（t=7.652，P＜ 0.01），即MITF的表達呈濃度依賴。

圖1 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細胞合成黑素的影響（Masson-Fontana染色×200） 1A：對照組，不加拉坦前列素的培養基組；1B：10-7 mol/L拉坦前列素組；1C：10-6 mol/L拉坦前列素組；1D：10-5 mol/L拉坦前列素組。隨拉坦前列素濃度的升高，黑素細胞樹突上的黑素顆粒數量增多，黑素顆粒的顯色從淡棕色加深至黑褐色

10-6mol/L 拉坦前列素組TYR mRNA 的表達顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L拉坦前列素組（t= 16.475、12.111、7.516，均P＜ 0.01），且 10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組亦高于對照組（t= 4.391、8.958，均P＜ 0.01）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYRP1 mRNA 的表達顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組（t= 23.846、24.281、3.013，均P＜0.05），10-5mol/L 拉坦前列素組顯著高于對照組（t= 20.833，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素組與對照組相比差異無統計學意義（t= 0.435，P=0.675）。

5.拉坦前列素對黑素合成關鍵基因蛋白表達的影響：見圖3。4 組間MITF、TYR、TYRP1 蛋白表達量差異均有統計學意義（F值分別為30.785、28.371、133.788，均P＜ 0.01）。

圖2 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細胞小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）mRNA 表達的影響 1：對照組，不加拉坦前列素的培養基組；2：10-7 mol/L 拉坦前列素組；3：10-6 mol/L 拉坦前列素組；4：10-5 mol/L拉坦前列素組。MITF的表達隨拉坦前列素濃度升高而增加，TYR、TYRP1的表達在10-6 mol/L拉坦前列素組最高。n=3。a：與對照組相比，P ＜ 0.01

圖3 不同濃度拉坦前列素對人表皮黑素細胞小眼畸形相關轉錄因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、酪氨酸酶相關蛋白1（TYRP1）蛋白表達的影響 3A：Western印跡檢測蛋白表達電泳圖；3B ～3D：各組黑素細胞MITF、TYR、TYRP1蛋白表達水平柱形圖。1：對照組；2 ～4：分別為10-7、10-6、10-5 mol/L拉坦前列素組。MITF的表達隨拉坦前列素濃度升高而增加，TYR、TYRP1的表達在10-6 mol/L拉坦前列素組最高。n=3。與對照組相比，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01

10-6、10-5mol/L拉坦前列素組MITF蛋白表達量均顯著高于對照組（t值分別為7.082、8.611，均P＜0.01）和10-7mol/L 拉坦前列素組（t值分別為7.082、4.149、5.679，均P＜ 0.01），但10-6與10-5mol/L 拉坦前列素組間差異無統計學意義（t= 1.530，P=0.165），10-7mol/L 拉坦前列素組高于對照組（t=2.932，P=0.019）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYR 蛋白的表達顯著高于對照組和10-7、10-5mol/L 拉坦前列素組（t值分別為7.567、8.125、3.884，均P＜ 0.01），10-5mol/L 拉坦前列素組顯著高于對照組（t=3.683，P＜ 0.01），而10-7mol/L拉坦前列素組與對照組相比差異無統計學意義（t=0.557，P=0.592）。

10-6mol/L 拉坦前列素組TYRP1蛋白的表達顯著高于對照組、10-7、10-5mol/L拉坦前列素組（t值分別為16.161、6.562、17.135，均P＜ 0.01），10-7拉坦前列素組顯著高于對照組（t= 9.599、P＜ 0.01），而10-5mol/L 拉坦前列素組與對照組相比差異無統計學意義（t=0.974，P=0.358）。

討 論

拉坦前列素作為眼科外用藥，導致患者虹膜、睫毛及眶周皮膚顏色加深的現象引起了學者的注意[12-13]。在確定此類色素沉著對眼功能及眼周皮膚無不良影響后，研究者針對拉坦前列素在色素脫失性疾病中的應用進行了一些臨床研究[3-6]，發現單用拉坦前列素治療白癜風，可取得較好的復色效果，將其分別與窄譜UVB（NB-UVB）、微針、Fraxel點陣激光和UVA 光療聯合治療時，復色效果更為顯著。

體外研究顯示[14-16]，拉坦前列素可誘導酪氨酸酶轉錄，增強酪氨酸酶活性，從而促進虹膜黑素細胞及黑素瘤細胞的黑素合成。為探究拉坦前列素對皮膚色素脫失性疾病的治療前景，我們探討拉坦前列素體外對人表皮黑素細胞增殖及黑素合成的影響，結果顯示，10-6、10-5mol/L 拉坦前列素可以促進人源表皮黑素細胞的增殖，并能顯著刺激酪氨酸酶活性增加和黑素合成。表明拉坦前列素或可通過酪氨酸酶相關代謝途徑誘導黑素合成。

黑素生成過程受多重因素調控，MITF 可調節神經嵴細胞的定向分化和細胞周期進展，參與黑素細胞分裂和黑素化，控制色素生成限速酶相關基因TYR、TYRP1等的表達，是黑素細胞發育存活、黑素生成功能的主要調節者[17]。MITF、TYR、TYRP1 的表達缺失會引起酪氨酸酶活性降低，減少黑素合成，造成皮膚色素脫失[18]。多種針對色素脫失性疾病的治療研究[19-21]均以MITF、TYR、TYRP1 為治療靶點，因此我們對上述3種因子從mRNA及蛋白水平進行檢測。結果顯示，拉坦前列素能不同程度促進MITF、TYR、TYRP1 mRNA 及蛋白的表達，其中MITF 表達的升高呈濃度依賴性，而TYR 和TYRP1的表達在10-6mol/L 拉坦前列素組最高。同時，酪氨酸酶活性與黑素合成水平也在10-6、10-5mol/L 濃度的藥物處理后顯著升高，故我們認為適宜濃度的拉坦前列素可能通過促進MITF、TYR、TYRP1 的mRNA 和蛋白表達對人表皮黑素細胞的生物活性產生促進作用。同時我們發現拉坦前列素對MITF、TYR、TYRP1 的促進作用并不平行，提示藥物可能通過多種機制影響黑素細胞TYR、TYRP1的表達，而非僅通過MITF-TYR 軸，即影響旁枝通路從而導致上游MITF 與下游TYR、TYRP1 基因表達受藥物濃度的影響不一致。此外，已測得拉坦前列素在人表皮黑素細胞中IC50值為8.8×10-5mol/L，拉坦前列素對TYR、TYRP1的表達及黑素細胞活性的作用或受較高濃度的影響。不可排除的是，此結果可能受實驗條件質控的影響，想要論證此藥是否為白癜風治療的有效、可靠藥物，需進行更充分與深入的研究。

綜上所述，本研究初步證實拉坦前列素可促進人正常黑素細胞增殖，并可能通過上調MITF、TYR、TYRP1 mRNA和蛋白水平促進酪氨酸酶活性和黑素合成。

因研究水平及條件所限，本研究存在一定的不足和局限性。本實驗的研究對象是正常的人表皮黑素細胞，如欲將拉坦前列素應用于白癜風患者患者的治療，選擇患者皮損處提取的表皮黑素細胞進行給藥實驗意義更大。此外，應用白癜風動物模型進一步探索會對拉坦前列素長期用藥的有效性、耐藥性及安全性的驗證有更大幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突