LC-IT-TOF-MSn快速鑒別沉香中2-(2-苯乙基)色酮類成分△

張倩，霍會(huì)霞，孫慧，許霞，夏暉，管朋維，王超超，李軍，趙云芳

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029

沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg 的含有樹脂的木材，具有緩瀉[1-2]、解痙[3]、鎮(zhèn)靜[4]、鎮(zhèn)痛、抗炎[5]等活性。野生白木香資源匱乏，目前“通體結(jié)香技術(shù)”提高了沉香的產(chǎn)量，且其質(zhì)量較好[6]。沉香主要含有2-(2-苯乙基)色酮類(41%)、倍半萜類(52%)和芳香族類化合物[7-8]，其中2-(2-苯乙基)色酮類僅來(lái)源于瑞香科植物，是沉香的特征性成分。該類成分由色酮環(huán)和芐基環(huán)通過(guò)CH2-CH2鍵相連，其取代基通常有一個(gè)或多個(gè)甲氧基或羥基。報(bào)道指出，色酮類成分對(duì)NO的生成具有明顯的抑制效果[9]，具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]，對(duì)人胃癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，2-(2-苯乙基)色酮類成分的特征質(zhì)譜行為是CH2-CH2鍵的斷裂，具有取代基時(shí)，會(huì)發(fā)生中性丟失，如四羥基四氫色酮在多級(jí)碎裂過(guò)程中會(huì)丟失H2O和CO[12]。另外，在色酮類成分的質(zhì)譜分析中，可以檢測(cè)到卓鎓離子，通過(guò)同位素標(biāo)記和理論計(jì)算可推斷自由基離子的形成過(guò)程[13]。通過(guò)超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜可以檢測(cè)到15種常見(jiàn)的有取代基的卓鎓離子碎片[14]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，不同類型的2-(2-苯乙基)色酮類成分具有不同的裂解規(guī)律。因此，本研究采用LC-IT-TOF-MSn對(duì)沉香中2-(2-苯乙基)色酮類成分進(jìn)行分析，以期為沉香的分析和質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

島津LC-20ADXR高效液相色譜儀，離子源為ESI源的離子肼-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(IT-TOF-MS)。質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲酸購(gòu)于Thermo Fisher公司，水為超純水，其他試劑為分析純。沉香藥材采自中國(guó)廣東省，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授鑒定為瑞香科植物白木香含有樹脂的木材。31個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類對(duì)照品均為自制，經(jīng)UV、IR、MS、1H NMR和13C NMR鑒定其結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化法測(cè)定其純度不低于95%，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取沉香藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇10 mL，超聲(500 W，40 kHz)處理30 min后放至室溫。取上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，注入液質(zhì)系統(tǒng)。

1.2.2 色譜方法 色譜柱為Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～20 min，10%～20%B；20～35 min，20%～25%B；35～55 min，25%～35%B；55～70 min，35%～38%B；70～90 min，38%～50%B；90～105 min，50%～70%B；105～120 min，70%B，120～121 min，70%～90%B，121～130 min，90%B。流速為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm。用2根PEEK管將液相流出液進(jìn)行1∶4分流，約20%流出液進(jìn)入質(zhì)譜分析。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定：正離子模式，自動(dòng)多級(jí)全掃描，掃描范圍為m/z100～1000，高純氮?dú)鉃殪F化氣和干燥氣，高純氬為冷卻氣和碰撞氣；檢測(cè)器電壓1.50 kV，加熱器溫度，200 ℃，CDL溫度，200 ℃；霧化氣1.5 L·min-1；接口電壓4.5 kV。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相、色譜柱類型、柱溫、流速等進(jìn)行了考察，對(duì)離子化模式、檢測(cè)器電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 31個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類對(duì)照品

注：A.對(duì)照品總離子流圖；B.沉香藥材總離子流圖；C.沉香藥材提取離子流圖。圖2 沉香藥材LC-IT-TOF-MSn圖

2.1 2-(2-苯乙基)色酮類成分的裂解規(guī)律

采用IT-TOF-MSn對(duì)31個(gè)對(duì)照品進(jìn)行分析，包括三元氧環(huán)四氫色酮(Ⅰ，19、41～42)，四羥基四氫色酮(Ⅱ，1～11)，氯代四氫色酮(Ⅲ，12和30)，簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮(Ⅳ，26、37～38、52、56～57、62、64、66～68、71、74、77、X)。其主要裂解途徑見(jiàn)圖3，特征碎片見(jiàn)表1～3。

圖3 2-(2-苯乙基)色酮類成分的裂解途徑

2.1.1 三元氧環(huán)四氫色酮(Ⅰ) [M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰是三元氧環(huán)四氫色酮MS1的主要碎片峰，其準(zhǔn)分子離子失去CO，可產(chǎn)生[M+H-CO]+和[M+H-2CO]+子離子。該類色酮的特征裂解行為即A環(huán)連續(xù)失去CO，見(jiàn)圖 4。當(dāng)B環(huán)無(wú)甲氧基取代時(shí)，可檢測(cè)到微量的6A+(m/z192.040 7)碎片離子，如對(duì)照品42，但當(dāng)4′-位有取代時(shí)，則未發(fā)現(xiàn)該離子，如對(duì)照品19和41。

2.1.2 四羥基四氫色酮(Ⅱ) 四羥基四氫色酮的特征碎片為[M+H]+和[M+H-H2O]+，特征碎片可進(jìn)一步丟失18 Da(H2O)、46 Da(H2O+CO)、74 Da(H2O+2CO)，連續(xù)丟失H2O和CO為該類色酮的特征裂解途徑[11]，這與之前的研究結(jié)果一致。另外，碎片峰[M+H-A ring-C ring-CH2]+(6B+ion)，即m/z91[C7H7](對(duì)照品6)、107[C7H6+OH](對(duì)照品1)、121[C7H7+OCH3](對(duì)照品7、9、11)和137[C7H7+OH+OCH3](對(duì)照品2、3、4)的存在，有助于推斷取代基的類型。

CH2-CH2鍵斷裂可形成6B+和6A+離子，但當(dāng)B環(huán)4’-位無(wú)甲氧基取代時(shí)，可以明顯的檢測(cè)到6A+離子，如對(duì)照品1、5、6、8和10。當(dāng)B環(huán)4’位-被甲氧基取代后，無(wú)法檢測(cè)到6A+離子。CH2-CH2鍵斷裂后通過(guò)中性丟失H2O和CO也可形成6A+離子，但當(dāng)B環(huán)有羥基取代時(shí)，6A+離子為[M+H-2H2O-6B+H]+，如化合物1和5，B環(huán)無(wú)羥基取代時(shí)，6A+離子為[M+H-2H2O-CO-6B]+。

表1 四羥基四氫色酮對(duì)照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表2 氯代四氫色酮和三元氧環(huán)四氫色酮對(duì)照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表3 簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮對(duì)照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖4 對(duì)照品42的裂解途徑

2.1.3 氯代四氫色酮(Ⅲ) 該類成分的特點(diǎn)是在質(zhì)譜圖中有同位素峰，同時(shí)由于氯原子的存在，失去HCl為其特征裂解行為，其裂解途徑見(jiàn)圖5。C11-C12的斷裂，會(huì)形成6B+碎片，如對(duì)照品30的m/z91.052 5[C7H7]碎片峰，對(duì)照品12的m/z137.059 6[C7H7+OH+OCH3]碎片峰，該碎片峰也是氯代四氫色酮的特征裂解行為。同時(shí)，通過(guò)6B+特征碎片可以判斷取代基的類型。

2.1.4 簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮(Ⅳ) 對(duì)于簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮，6B+碎片離子為其特征碎片。當(dāng)B環(huán)有甲氧基取代時(shí)，可以檢測(cè)到[6B-·CH3]+和[6B-OCH3]+碎片離子。此外，當(dāng)4’-位無(wú)甲氧基取代時(shí)，可以檢測(cè)到6A+碎片離子，如對(duì)照品38、56、67、74等。

該類型色酮的特征裂解方式是發(fā)生在C環(huán)的RDA裂解。如對(duì)照品X，在其MS2譜中可以檢測(cè)到m/z121.028 8(1，3A+)碎片離子，其裂解途徑見(jiàn)圖6。簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮具有相同的母核結(jié)構(gòu)，羥基取代或甲氧基取代可以生成特征碎片如m/z151[C7H4O2+OCH3]、167[C7H4O2+OCH3+OH]、181[C7H4O2+2OCH3]、153[C7H4O2+2OH]，137[C7H4O2+OH]等，通過(guò)這些特征碎片，可以判斷取代基的類型和數(shù)量。

圖5 氯代四氫色酮的裂解途徑

圖6 對(duì)照品X的裂解途徑

2.2 沉香中2-(2-苯乙基)色酮類成分的分離鑒別

利用上述裂解特征，對(duì)沉香藥材中的2-(2-苯乙基)色酮類成分進(jìn)行了分離鑒別，最終檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了77個(gè)色酮類成分，包括4個(gè)三元氧環(huán)四氫色酮，18個(gè)四羥基四氫色酮，4個(gè)氯代四氫色酮，51個(gè)簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮。以下舉例說(shuō)明2-(2-苯乙基)色酮類成分的鑒別過(guò)程。

色譜峰31的準(zhǔn)分子離子峰為m/z283.096 2，在其MS2譜中，可檢測(cè)到m/z255.100 1、227.104 7、192.035 8和164.046 3的碎片峰。分析發(fā)現(xiàn)，這些碎片是分別通過(guò)丟失CO、2CO、B ring和CO+B ring 產(chǎn)生的。上述裂解行為與對(duì)照品42相似，見(jiàn)圖7。因此色譜峰31鑒定為對(duì)照品42的同分異構(gòu)體，為三元氧環(huán)四氫色酮。

色譜峰13、[M+H-H2O]+，[M+H-H2O-CO]+和6B+是其主要的碎片峰，同時(shí)m/z137.060 6提示B環(huán)有1個(gè)羥基和1個(gè)甲氧基，但由于未檢測(cè)到6A+碎片離子，因此推斷甲氧基取代基在B環(huán)的4’-位。當(dāng)B環(huán)僅含有1個(gè)羥基和1個(gè)甲氧基時(shí)，四羥基四氫色酮類成分的結(jié)構(gòu)同對(duì)照品2、3和4相似，其分子式為C18H20O8。色譜峰13與之相較，多18 Da(H2O)。因此推斷色譜峰13的A環(huán)存在臨位羥基和1個(gè)三元氧環(huán)取代，同對(duì)照品19相比，色譜峰13擁有相似的裂解途徑，見(jiàn)圖8。因此色譜峰13鑒定為5，6-epoxy-7，8-dihydroxy-2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]-5，6，7，8-tetrahydrochromone，為四羥基四氫色酮。

由于同位素峰的存在，色譜峰12，29，30和36鑒定為氯代四氫色酮。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，色譜峰12和30進(jìn)行了確證。在色譜峰29和36的質(zhì)譜圖中，均可檢測(cè)到準(zhǔn)分子離子峰m/z367[M+H]+、碎片離子m/z349[M+H-H2O]+和6B+。碎片峰m/z121的存在可以推斷其有一個(gè)甲氧基取代基。另外，色譜峰29的碎片峰m/z331.071 5[M+H-2H2O]+和295.086 9[M+H-2H2O-HCl]+提示A環(huán)至少有兩個(gè)羥基取代基。同對(duì)照品30相較，色譜峰29具有相似的碎裂途徑，即-H2O、-2H2O、-2H2O-HCl，且均可檢測(cè)到6B+碎片離子。因此，色譜峰29鑒定為 5，6，7-trihydroxyl-4′-methoxyl-chloro-substituted-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone，色譜峰36為其異構(gòu)體。

注：A、B為一級(jí)質(zhì)譜圖；C、D為二級(jí)質(zhì)譜圖；E、F為三級(jí)質(zhì)譜圖。圖7 對(duì)照品42和色譜峰31的質(zhì)譜圖

注：A、B為一級(jí)質(zhì)譜圖；C、D為二級(jí)質(zhì)譜圖；E、F為三級(jí)質(zhì)譜圖。圖8 對(duì)照品19和色譜峰13的質(zhì)譜圖

注：A、B為一級(jí)質(zhì)譜圖；C、D為二級(jí)質(zhì)譜圖；E、F為三級(jí)質(zhì)譜圖。圖9 對(duì)照品30和色譜峰29的質(zhì)譜圖

在色譜峰14、16和17的質(zhì)譜圖中，均可以觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z303和加鈉峰m/z325。通過(guò)中性丟失H2O、2H2O和2H2O+CO產(chǎn)生了碎片峰m/z285、267和239，推測(cè)A環(huán)至少含有3個(gè)羥基取代基，但均未檢測(cè)到6B+碎片峰。由圖1看出，所有的簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮均含有相同的母核結(jié)構(gòu)(C17O2Hy)，通過(guò)預(yù)測(cè)分子式和C17O2Hy之間C和H數(shù)量的差異可以推斷取代基的類型。 因此，我們推斷3個(gè)化合物均是含有3個(gè)羥基取代基，但無(wú)法判斷其取代位置。3個(gè)色譜峰鑒定為trihydroxy-2-(2-phenethyl)-pentahydro-4H-chromen-4-one異構(gòu)體。

注：A、B、C為一級(jí)質(zhì)譜圖；D、E、F為二級(jí)質(zhì)譜圖。圖10 對(duì)照品26和色譜峰27、28的質(zhì)譜圖