CRISPR/Cas技術及其在作物遺傳育種中的應用

劉 忠 奇

（1湖南農業大學農學院，長沙410128；2中國種子集團有限公司，北京100045）

基因編輯技術具有巨大的應用價值。目前主要有類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）［1］、鋅指核酸酶（ZFN）［2］和成簇規律間隔短回文重復序列及其關聯蛋白（CRISPR Cas9和 CRISPR Cpf1）［3］三大基因編輯技術。由于基因組編輯技術克服了周期長、突破物種間生殖隔離限制及快速高效的優勢而被科學界關注。基因組編輯技術可用于基因修復（Gene correction）、基因敲除 （Knock-out）和實現靶向（Targeted）插入目標基因［4］。作為基因編輯技術的后起之秀，CRISPR/Cas9系統因其精準性、高效性、低成本性和簡易性，而受到各界密切關注，而且在越來越多的研究領域得到應用。筆者擬介紹基因編輯CRISPR/Cas系統的作用機理以及該系統在作物遺傳育種中的最新研究和應用進展，并就該項技術在植物遺傳育種應用中的新思路及安全性提出新的方向。

1 CRISPR/Cas與ZFN、TALEN的作用機理及異同

目前應用最廣泛的基因組編輯技術主要有ZFN（zinc finger nuclease）、TALEN（transcription activator-like effector nuclease）和 CRISPR/Cas，它們均能對植物基因組進行精準的替換、插入和定點敲除，其在作物重要性狀的遺傳改良和控制作物重要農藝性狀基因的功能鑒定領域具有巨大的應用潛力。

ZFN技術是最早興起的第1代基因組編輯技術。ZFN是由一系列位點特異性的融合蛋白組成，主要包含鋅指蛋白的DNA結合域和核酸內切酶FokⅠ的切割結構域［5］。將鋅指蛋白與核酸內切酶FokⅠ融合形成核酸內切酶，利用它可以在各種復雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。但ZFN存在設計鋒指核酸酶耗時耗力、鋅指核酸酶上下游效應等導致脫靶效應、ZFN本身的細胞毒性等缺陷，制約了ZFN在基因組編輯中的應用。

TALEN是一種毒性蛋白，由黃單胞桿菌（屬植物病原菌）通過Ⅲ型分泌系統釋放到宿主細胞中通過模擬真核細胞轉錄因子對宿主細胞實現重編程［6］。TALEN與ZFN類似，其原理一樣，均由DNA結合蛋白與核酸內切酶FokⅠ融合而成。對每個新的目標序列，兩種基因編輯技術都需要設計一個新的DNA長片段（500～1500堿基對）來合成相應的目的蛋白。由于非特異性核酸內切酶FokⅠ形成二聚體才有內切酶活性，ZFN和TALEN均需要合成兩個新的蛋白。綜上，上述兩種技術相對費時且效率低。

CRISPR/Cas是來源于細菌和古生菌抵抗病毒或外源質粒入侵的獲得性免疫系統［7］，主要有3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。被廣泛應用的主要是Ⅱ型系統，以 Cas蛋白（Cas9、Cpf1、C2c1和 C2c2）以及導向RNA（gRNA）為核心組份。主要依賴于核酸內切酶在目標位置產生雙鏈斷裂 （double strand breaks，DSBs），DSBs再通 過 非 同 源 末 端 連 接（NHEJ）和同源重組（HDR）兩種方式進行修復。NHEJ在斷裂位點誘發堿基缺失或插入突變，故可針對不同靶位點設計不同單向導RNA（sgRNA）在特定的位點實現基因編輯，包括間隔序列的獲取、CRISPR/Cas系統的表達和CRISPR/Cas系統對外源基因的干擾三個階段［8］。Cas9蛋白作為Ⅱ型系統的核心蛋白，具有加工產生 crRNA（CRISPR RNA）和切割外源核酸的功能，Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA（反式激活crRNA）三者共同作用即可對外源 DNA進行靶向裂解［9～11］。CRISPR/Cas9對 DNA的靶向切割作用使其可以用來進行基因組編輯。在特定的區域內，CRISPR/Cas9可以同時編輯多個基因位點［12～17］。最近從氨基酸球菌屬中分離出的CRISPR/Cpf1（V-A）系統，在哺乳動物特定位點中的編輯效率更高［18］。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas都是有效的基因組編輯技術，三者在編輯效率、特異性和設計上存在較大差異（表1）。

表1 三大基因編輯技術比較Table 1 Comparison of the differences between the threemajor gene editing technologies

2 CRISPR/Cas9技術在植物基因功能研究中的應用

CRISPR/Cas系統通過產生DNA雙鏈斷裂激活植物內源修復途徑（包括非同源粘性末端連接和同源重組修復）實現對靶位點的定點突變、缺失或者基因的插入與替換。

2.1 基因敲除

王芳權等［19］利用CRISPR/Cas9技術對水稻品種南粳9108中的Pi21基因進行敲除，獲得78.57%的突變效率，且靶位點突變類型較多。Wang等［20］通過 CRISPR/Cas9技術敲掉了六倍體植物小麥的TaMLO基因，獲得了抗白粉病小麥新品系。Gao等［21］通過CRISPR/Cas9系統敲除煙草的2個基因NtPDS和NtPDR6，發現16.2%～20.3%的插入或缺失頻率。劉耀光實驗室開發的多靶點CRISPR/Cas9系統，更加有效地實現了多基因定點突變及大片段缺失，他們在水稻中編輯了46個目標位點，平均突變率為85.4%，且大部分為雙等位和純合狀態［13］。

2.2 基因插入或替換

胡雪嬌等［22］采用CRISPR/Cas9系統矮化水稻恢復系申繁17和申繁24獲得了較野生型矮25%的SD1突變體，以SD1基因為靶基因，構建基因編輯載體CRISPR-SD1，T0代獲得了純合的sd1突變體，T1代株系中分離出了不含轉基因序列的植株。Fang等［23］通過CRISPR/Cas9系統以大豆疫霉菌的RXLR效應基因Avr4/6作為靶標進行編輯，導致Avr4/6基因被NPTII基因替換。

Feng等［24］采用CRISPR/Cas9技術對擬南芥和水稻3個容易觀察表型的基因（ROC5、SPP和YSA）進行了編輯，結果顯示在T1代轉基因株系中，SPP突變效率為5%，ROC5和YSA突變效率高達26%～84%。Lu等［25］利用單堿基編輯系統APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），首次實現了對水稻氮轉運蛋白家族NRT1.1B和 DELLA家族SLR1的堿基替換。Upadhyay等［26］成功地運用基因編輯技術在懸浮細胞中，多重的sgRNA定位兩個不同識別位點，將兩個小麥內源基因Ta INOX和Ta PDS突變掉，突變率達到18%～22%。

以上均表明CRISPR/Cas9系統（敲除、插入或替換）在植物T0代轉化中是高效的，很容易找到靶標基因完成編輯的純合子，篩選得到純合的T0代突變株系。這些基因能夠穩定地遺傳給T1代，且符合孟德爾分離規律。

2.3 候選基因功能預測

利用CRISPR/Cas9技術對小麥Ta MLO進行定向突變，在原生質體和轉基因植物中的鑒定結果表明，突變只發生在 A基因組上［27］。Gao等［28］通過CRISPR/Cas9技術定點編輯產生ABP1的無效突變體abp1，并發現abp1不對外源的生長素表現抗性，故認為ABP1不是擬南芥生長素信號傳導過程中的關鍵因子。Sun等［29］運用CRISPR/Cas9設計了一個攜帶Cas9，兩個gRNA和作為同源性修復模板的一個供體片段的質粒，試圖通過質粒轟擊，在水稻ALS基因中同時替代兩個氨基酸殘基（W548到L和S627到I），從再生苗中隨機選擇52株進行分析，測序結果表明，所有分析的植物中都發生了CRISPR/Cas9介導的同源性修復，獲得了純合的抗除草劑水稻植株。

Svitashev等［30］使用127 nt的單鏈 DNA寡核苷酸作為修復DNA模板并與Cas9-ALS-gRNA RNP復合物共同轟擊，在玉米乙酰乳酸合酶基因（ALS2）中直接將對應于氨基酸位置165處的Pro的DNA序列編輯為Se（P165S），產生氯磺隆抗性玉米植株。從1個再生植株中檢測到編輯的ALS2等位基因的DNA序列分析證實了P165S修飾的存在以及與相應修復模板相關的其他核苷酸變化。進一步的分子分析和后代測試表明，T1植株對氯磺隆具有抗性，且后代符合孟德爾分離規律。Yin等［31］利用CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1系統分別敲除水稻OsEPFL9基因（EPFL9基因為氣孔發育的正調節因子），獲得的純合突變體水稻背軸葉表面上的氣孔密度顯著降低。Xu等［32］針對水稻除草劑抗性基因BEL設計3個不同gRNAs，分析發現CRISPR/Cas系統突變效率在2%～16%，表型分析顯示轉基因植株對除草劑苯達松敏感。

3 CRISPR/Cas9技術在植物分子育種中的應用

CRISPR/Cas9系統具有簡單易行、突變效率高、成本低、多靶點同時突變等優越性，能有效地應用于水稻的遺傳改良。現在利用CRISPR/Cas9技術開展與產量、品質及抗性相關的研究已有大量報道。

在產量方面，王加峰等［33］利用CRISPR/Cas9技術對調控水稻千粒重的基因TGW6定點編輯，T0代材料中該基因突變頻率約為90%，其中純合缺失突變率高達51%，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。

Zhang等［34］利用 CRISPR/Cas9系統對小麥粒長和粒重調控基因Ta GASR7和穗密度調控基因Ta DEP1進行定點編輯，獲得的Ta GASR7純合。Soyk等［35］采用 CRISPR/Cas9技術對番茄抗成花基因SP5G進行定向編輯，突變體材料番茄開花及成熟時間提前約2周，且產量顯著增加。

在品質方面，Tang等［36］利用 CRISPR/Cas9系統敲除金屬轉運蛋白基因OsNramp5，顯著降低秈稻谷粒中的鎘含量，開發具有低Cd積累和無轉基因的新秈稻品系。中國水稻研究所［37］和東北地理與農業生態研究所［38］同時采用CRISPR/Cas9技術對控制水稻香味的BADH2基因進行敲除，結果表明突變體材料中香味物質顯著增加。Ma等［13］利用CRISPR/Cas9技術靶向突變直鏈淀粉合成酶基因OsWaxy，突變體直鏈淀粉含量從14.6%下降至2.6%，獲得了糯性品質。

在抗性方面，Li等［39］將 CRISPR/Cas9系統成功應用于編輯大豆的乙酰乳酸合成基因1（ALS1）并獲得了氯磺隆抗性基因。Wang等［20］通過CRISPR/Cas9技術敲掉了六倍體植物小麥的Ta MLO基因，獲得了抗白粉病小麥新品系。中國科學院遺傳與發育生物學研究所，利用NHEJ修復方式建立了基于CRISPR/Cas9的基因組定點插入及替換系統，在水稻內源基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）中實現基因替換，頻率為2.0%，靶向基因插入，頻率為2.2%，所獲OsEPSPS基因的水稻對草甘膦具有抗性［40］。Liu等［41］利用CRISPR/Cas9基因修飾增強水稻抗稻瘟病能力，設計針對水稻OsERF922基因的CRISPR/Cas9 SSN（C-ERF922），從50個T0轉基因水稻中鑒定出21個C-ERF922誘導的突變體（突變率42.0%），獲得了6個抗稻瘟病株系。

在篩選不育系方面，主要利用CRISPR/Cas9系統對秈稻和粳稻品種的溫敏不育基因TMS5的野生型基因進行突變，可快速培育出溫敏不育系。2016年，張大兵等利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯粳稻品種空育131內源基因csa，獲得了粳型光敏核雄性不育系［40］。同年 11月，莊楚雄等利用 CRISPR/Cas9技術對水稻溫敏核雄性不育基因TMS5進行特異性編輯，創制了一批溫敏核雄性不育系［41］。

4 CRISPR/Cas9技術的脫靶問題及應對策略

CRISPR/Cas作為一種新型的應用技術，雖然具有高效、廉價和易操作的優勢，但是也有多變效應，即脫靶問題。為了提高效率，越來越多的研究著眼于控制CRISPR/Cas9系統的脫靶突變。gRNA和同源序列中選擇具有最少的錯配位點和脫靶位點的目的位點［42～44］，有助于確保 CRISPR/Cas9的識別特異性。由于Cas9核酸酶在植物中有較高的編輯效率和特異性［45］，選擇合適的靶點顯得尤其重要，因此在農作物中比較容易得到一個脫靶率非常低的純合突變體。有研究者將Cas9轉換成切口酶，同樣能夠幫助減少脫靶突變，確保CRISPR/Cas9定點切割的效率。CasOT是最近發明的一個靈活的選擇工具，能夠識別整個基因組中潛在的脫靶位點［44］。新型小核酸酶Cpf1是可代替Cas9的有效工具，具有更高的精確性和更簡便的操作性，能降低脫靶效應。

5 展望

基因組編輯技術在植物育種的背景下進行應用，重點是開發新品種。優化現有技術，創新新型基因組編輯育種技術，開發具有自主知識產權的DNA-free剪切酶技術，有助于提高基因組編輯技術的精確性和高效率性。

此外，基因編輯作物是否屬于轉基因生物在國際上尚沒有明確的定論，其監管標準也存在爭議。所以加強基因編輯作物的監管法規建設十分必要，應組織科學界、管理者、產業界等共同研討，制定切實可行的法規，嚴格監控其應用范圍和程度，在符合安全標準的情況下發展基因組編輯育種技術。由于CRISPR/Cas9系統編輯的作物可以不引入外源基因，得到純合的突變體，與天然植物基因突變一樣，具有穩定的遺傳能力，隨著全基因組測序的完成和更多有利性狀或基因被發現，基因編輯技術必將在植物育種界對新種質資源的創制和農藝性狀的精準改良產生深遠的影響。