殼聚糖氨基選擇性功能化中的空間位阻效應(yīng)

熊金輝，柏正武

武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205

甲殼素是由D-2-乙酰氨基-2-脫氧-葡萄糖經(jīng)β-1，4-糖苷鍵連接而成的線型縮聚物［1］，當(dāng)側(cè)鏈上乙酰基的脫除率達到55%時，生成的產(chǎn)物被稱為殼聚糖［2］。因為甲殼素很容易從蝦或蟹的軀殼中獲得，蝦殼和蟹殼是常用海鮮食品的殘渣，所以甲殼素和殼聚糖的來源非常豐富，廉價易得。殼聚糖的用途非常廣泛，如用來制備生物醫(yī)用材料［3-5］，用作吸附劑除去污染物或重金屬離子等［6-7］。因殼聚糖有單手螺旋的高級結(jié)構(gòu)，能形成不對稱的空腔，所以殼聚糖還能用來制備手性分離材料［8-10］。

與其它的天然高分子化合物相似，在未被修飾之前，殼聚糖的功能很有限，但經(jīng)過修飾以后，其功能才得以充分展示。殼聚糖重復(fù)單元的3-位和6-位上是羥基，而2-位上是氨基。因羥基和氨基的反應(yīng)活性不同，可對殼聚糖的氨基進行選擇性的修飾，而無需對羥基進行保護和脫保護。有大量文獻報道了對殼聚糖的氨基進行選擇性的修飾，制備成不同用途的材料［11-13］。但要對殼聚糖的氨基進行高取代度修飾，如取代度達到95%或以上，則很難實現(xiàn)。在現(xiàn)實中，往往存在這種情況，即要求殼聚糖修飾時的取代度近乎100%，才能滿足材料應(yīng)用的要求。如在合成多糖衍生物手性分離材料時，為保證多糖衍生物高級結(jié)構(gòu)的規(guī)整性，就要求在修飾多糖時，取代度盡可能達到100%。在前期工作中，報道了選擇性地修飾殼聚糖2-位上的氨基生成酰胺、脲或者氨基甲酸酯，但并未較深入地研究上述3 種反應(yīng)的影響因素，如修飾試劑的結(jié)構(gòu)對反應(yīng)的影響等。鑒此，本文就修飾試劑的空間位阻對以上反應(yīng)產(chǎn)物取代度的影響進行了研究，并做了相應(yīng)的討論。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

甲殼素（山東濰坊海之源生物制品有限公司）；2-甲基環(huán)丙基甲酸，二碳酸二叔丁基酯，特戊胺，其它用于合成的試劑（分析純，國藥集團試劑公司）。甲殼素的脫乙酰化反應(yīng)按文獻［14］方法進行，脫乙酰度＞98.3%。

Bruker AVANCE III 600 MHz 核磁共振儀（瑞士布魯克公司）；Varian 400 MHz 核磁共振儀（美國瓦里安公司）。

1.2 殼聚糖的N-酰基化

方 法 一［15］：將1.0 g 殼 聚 糖 加 入 到 濃 度 約 為0.3 mol/L 的水溶性有機酸中，攪拌至澄清透明。向此溶液中加入30 mL 甲醇，攪拌均勻，再加入9 倍濃度的這種有機酸的酸酐溶于70 mL 甲醇的溶液。反應(yīng)混合液于室溫下攪拌7 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入270 mL 0.5 mol/L 氫氧化鉀乙醇溶液中，攪拌過夜。過濾，用乙醇洗滌至中性，真空干燥，得酰基化殼聚糖，產(chǎn)率在80%以上。

方法二［16-17］：先按“方法一”修飾殼聚糖，得到不完全酰基化的殼聚糖。取1.0 g 不完全酰基化的殼聚糖溶解于10 g 1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體中，攪拌至完全溶解。加入2 mL 乙醇，攪拌均勻后，滴加6倍濃度的酸酐，在室溫下攪拌反應(yīng)7 h。后處理及純化的方法與“方法一”中的相同。

方法三［8］：將1.0 g 殼聚糖加入30 mL 質(zhì)量分數(shù)為0.8%的鹽酸溶液中，攪拌至澄清透明。在冰水浴冷卻下，加入100 mL 甲醇，攪拌均勻，在15 ℃下，滴加9 倍濃度的酸酐溶于20 mL 甲醇的溶液，同時加入三乙胺，使反應(yīng)液的酸性保持在近中性。在室溫下劇烈攪拌7 h。后處理及純化方法與“方法一”中的相同。

1.3 脲基化殼聚糖的制備［18］

將3.0 g 殼聚糖溶于90 mL 質(zhì)量分數(shù)約為1%的鹽酸溶液中，在冷卻下加入90 mL 甲醇，攪拌均勻。將溶液冷至5 ℃左右，在此溫度下，加入9 倍濃度的氯甲酸甲酯或者氯甲酸乙酯，滴加三乙胺，調(diào)反應(yīng)混合液的pH 值為2～7，控制反應(yīng)溫度在5 ℃左右，攪拌反應(yīng)7 h。反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中加100 mL 乙醇，劇烈攪拌，過濾，用乙醇洗至中性，干燥，得甲氧基羰基殼聚糖，產(chǎn)率95%。

在80 ℃下，將1.0 g 甲氧基羰基殼聚糖溶于15 mL 質(zhì)量分數(shù)為10%的LiCl 在DMAc 中的溶液。稍冷后，加入10 倍濃度的有機胺，攪拌均勻。將溫度升至120 ℃，并保持12 h。冷卻，用乙醇處理反應(yīng)混合物，過濾，用乙醇徹底洗滌凝膠狀的固體3次，干燥，得脲基化的殼聚糖，產(chǎn)率在90%以上。

1.4 烷氧基羰基殼聚糖的合成［19］

將1.5 g 殼聚糖溶于20 mL 質(zhì)量分數(shù)為1.2%的鹽酸中，再加入20 mL 甲醇，攪拌，冰水浴冷卻。在4 ℃下，加入5 倍濃度的氯甲酸烷基酯，攪拌反應(yīng)約15 min。取與氯甲酸烷基酯相同摩爾數(shù)的三乙胺溶于10 mL 甲醇相混合，將此溶液間歇地滴加到反應(yīng)混合液中，使反應(yīng)液的pH 值維持在6 左右，直至滴加完畢。按氯甲酸烷基酯中烷基的大小，在4～30 ℃內(nèi)反應(yīng)適當(dāng)?shù)臅r間。反應(yīng)完畢，將反應(yīng)混合物倒入250 mL 乙醇中，同時攪拌。過濾，用乙醇洗滌中性，干燥，得部分取代的烷氧基羰基殼聚糖。上述過程稱之為殼聚糖的“第一次”烷氧基羰基化反應(yīng)。

在80 ℃下，將2.0 g LiCl 溶解在20 mL DMAc中，加入上述部分取代的烷氧基羰基殼聚糖，攪拌24 h 使之完全溶解。用冰水浴代替加熱裝置冷卻得到的溶液，在5 ℃下，加入1 mL 甲醇，再加入與原來使用的殼聚糖相同摩爾數(shù)的氯甲酸烷基酯，分批加入相同摩爾數(shù)的三乙胺，在4～30 ℃下攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入乙醇中，攪拌，過濾，用乙醇洗至中性，干燥，得到烷氧基羰基殼聚糖，產(chǎn)率在90%以上。上述過程稱之為殼聚糖的“第二次”烷氧基羰基化反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖的酰基化

在對殼聚糖的氨基進行選擇性酰基化時，先將殼聚糖溶解在與酰基化相應(yīng)的有機酸中，比如進行乙酰化，就將殼聚糖溶解在乙酸中。避免用一種有機酸溶解，而用另一種有機酸的酸酐做酰基化試劑。因為一種有機酸和另一種有機酸的酸酐之間能發(fā)生反應(yīng)生成混合酸酐，這種混合酸酐也能與殼聚糖上的氨基反應(yīng)，可能生成不需要的酰基化產(chǎn)物。當(dāng)有機酸在水中的溶解度較小時，可采用“方法二”或者“方法三”來合成酰基化殼聚糖。在“方法二”中，有機酸在水中有一定的溶解度，但較小，所以只能配置濃度較小的殼聚糖溶液。先以“方法一”合成取代度不高的酰基化殼聚糖，然后用離子液體做溶劑，再進一步使殼聚糖酰基化，從而制得近乎完全取代的酰基化殼聚糖［16］。對于在水中溶解度太小的有機酸，則采用“方法三”來合成酰基化殼聚糖。先將殼聚糖溶解在稀鹽酸中，再向反應(yīng)液中加入酸酐和三乙胺。三乙胺使殼聚糖的氨基游離出來，然后再與酸酐反應(yīng)。但在“方法一”和“方法二”中則無需加三乙胺等堿性物質(zhì)，因為絕大多數(shù)有機酸的酸性較弱，有機酸與氨基生成的弱酸弱堿鹽能較大程度上理解成游離的氨基。以“方法三”也能合成出近乎完全取代的酰基化殼聚糖［8］。

圖1 1H NMR 譜圖（600 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：（a）“方法一”制備的環(huán)丙甲酰化殼聚糖，（b）“方法一與（c）用“方法二”制備的2，2'-二甲基環(huán)丙基甲酰化殼聚糖Fig.1 1H NMR spectra of（600 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：cyclopropylcarbonyl chitosan prepared by（a）method 1 and 2，2'-dimethylcyclopropylcarbonyl chitosans prepared by（b）method 1 and（c）method 2

在研究中發(fā)現(xiàn)，含不同大小空間位阻的酸酐與殼聚糖上氨基反應(yīng)時的活性存在差異，進而對殼聚糖酰基化反應(yīng)的取代度有較大影響。如以環(huán)丙基甲酸酐與殼聚糖反應(yīng)，僅用“方法一”進行一次酰基化反應(yīng)能得到近100%取代的環(huán)丙基羰基殼聚糖［圖1（a）］；而使用空間位阻稍大的2，2'-二甲基環(huán)丙基甲酸酐與殼聚糖反應(yīng)在相同的條件下，一次酰基化殼聚糖的取代度只有79%［圖1（b）］，當(dāng)用“方法一”和“方法二”進行2 次酰基化反應(yīng)后，取代度才能達到100%［圖1（c）］。同樣地，采用“方法一”以特戊酸酐修飾殼聚糖氨基，一次酰基化反應(yīng)產(chǎn)物的取代度只有47%［圖2（a）］，即使用“方法二”以特戊酸酐修飾2 次，取代度也只有78.6%［圖2（b）］。而用比特戊酸酐少1 個甲基的異丁酸酐以“方法一”修飾殼聚糖，只需1 次修飾，取代度就能達到近99%［圖2（c）］。由此可見，空間位阻效應(yīng)會明顯影響一些酰基化反應(yīng)的取代度。比較用環(huán)丙甲酸酐、異丁酸酐和特戊酸酐修飾殼聚糖氨基產(chǎn)物的取代度可知，當(dāng)酸酐中的羰基α-碳原子為仲碳時，用“方法一”或者“方法一”與“方法二”連用，所制備的酰基化殼聚糖的取代度接近100%，當(dāng)α-碳原子為叔碳時，取代度相對較低。

圖2 1H NMR 譜圖（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：（a）“方法一”與（b）“方法二”制備的特戊酰化殼聚糖，（c）用“方法一”制備的異丁酰化殼聚糖Fig.2 1H NMR spectra of（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：tepentylcarbonyl chitosans prepared by（a）method 1 and（b）method 2 and（c）isobutylcarbonyl chitosanprepared by method 1

2.2 殼聚糖的脲基化

在本文中，殼聚糖的脲基化由2 個反應(yīng)組成，即殼聚糖的氨基甲酸酯化

和隨后的胺-酯交換反應(yīng)。因氨基甲酯中的甲氧基或乙氧基容易離去，所以殼聚糖氨基甲酸甲酯或氨基甲酸乙酯對合成殼聚糖脲來說是理想的中間體。但殼聚糖氨基甲酸甲酯或乙酯對水、酸、堿和熱都不太穩(wěn)定，不宜長期保存，最好在較短的期間內(nèi)使用。胺-酯交換反應(yīng)需要在較高的溫度下才能發(fā)生，經(jīng)過實驗摸索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達到110～120 ℃時，反應(yīng)迅速發(fā)生，并伴隨著產(chǎn)物的凝膠化。

胺的空間位阻對胺-酯交換反應(yīng)有明顯影響，用異丁基胺發(fā)生胺-酯交換反應(yīng)時，異丁基的取代度近乎100%［圖3（a）］，但用多一個甲基的新戊胺發(fā)生胺-酯交換反應(yīng)時，新戊基的取代度只有87%［圖3（b）］。比較異丁基胺和新戊胺的結(jié)構(gòu)可知，兩者氨基的α-碳原子都是亞甲基，在β-碳原子上，新戊胺比異丁基胺多連接1 個甲基。雖然甲基并不是一個空間位阻很大的基團，但使新戊基的取代度比異丁基的取代度低11%，足可見胺的空間位阻對胺-酯交換反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有非常顯著的影響。

圖3 1H NMR 譜圖（600 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：（a）殼聚糖異丁基脲，（b）殼聚糖新戊基脲Fig.3 1H NMR spectra（600 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：（a）chitosan isobutylurea，（b）chitosan neopentylurea

2.3 殼聚糖N-甲酸烷基酯化

過量的氯甲酸甲酯和氯甲酸乙酯這兩種烷基較小的酯能使殼聚糖完全氨基甲酸酯化，但對于烷基稍大一些的氯甲酸酯來說，只發(fā)生一次反應(yīng)，不能使殼聚糖完全氨基甲酸酯化，即取代度不能達到接近100%。如氯甲酸異丙基酯與殼聚糖反應(yīng)，經(jīng)過一次反應(yīng)，異丙基的取代度僅為85%［圖4（a）］，以LiCl/DMAc 為溶劑進行第二次N-甲酸酯化后，異丙基的取代度才能達到98%［圖4（b）］，說明氯甲酸烷基酯的空間位阻對殼聚糖的氨基甲酸酯化也有顯著的影響。由于不同的氯甲酸酯空間位阻大小不同，其對殼聚糖進行氨基甲酸酯化時的反應(yīng)活性亦有差異，因此，在實施該反應(yīng)時有一個適應(yīng)的反應(yīng)溫度。如果溫度過低則反應(yīng)速率過慢；反之，如果溫度過高則氯甲酸酯的水解也會加劇。這些情況都不利于殼聚糖的完全氨基甲酸酯化。采用氯甲酸十二烷基酯與殼聚糖反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在室溫下該反應(yīng)幾乎不能發(fā)生，而當(dāng)溫度高達40 ℃時，十二烷基的取代度也只有59%（圖5）。其原因可能是由于氯甲酸十二烷基酯的烷基鏈太長，空間位阻大，當(dāng)一部分氯甲酸十二烷基酯與殼聚糖的氨基反應(yīng)后，給生成的殼聚糖十二烷基氨基甲酸酯帶來太大的空間位阻，導(dǎo)致氯甲酸十二烷基酯無法再與其剩余的氨基反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)溫度過高時，大部分的氯甲酸十二烷基酯與水發(fā)生了反應(yīng)，只有少部分與殼聚糖氨基反應(yīng)。

圖4 1H NMR 譜圖（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）：（a）一次修飾，（b）兩次修飾制備的殼聚糖異丙基氨基甲酸酯Fig.4 1H NMR spectra（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）of isopropyloxycarbonyl chitosans prepared by（a）the first time and（b）the second time modifications

圖5 十二烷氧基羰基殼聚糖1H NMR 譜圖（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）Fig.5 1H NMR spectrum of dodecyloxycarbonyl chitosan（400 MHz，F(xiàn)3CCO2D）

在上述的反應(yīng)中，所選用修飾試劑的取代基不同，修飾試劑空間位阻的大小會有差別，從而對殼聚糖衍生物取代度造成不同的影響。在合成N-酰基化殼聚糖、脲基化殼聚糖和殼聚糖氨基甲酸烷基酯時，修飾試劑的空間位阻都不能太大，否則要進行二次修飾，甚至在進行二次修飾后，也不能制備出完全取代的殼聚糖衍生物。空間位阻對殼聚糖的N-酰基化、脲基化和氨基甲酸酯化這3 個反應(yīng)的影響程度各不相同，從實驗結(jié)果來看，修飾試劑的空間位阻對后2 個反應(yīng)的影響更大。