冰敷與熱敷分別聯合推拿對家兔急性骨骼肌損傷修復作用的比較

李應志， 張吉， 邵長麗， 邰先桃， 王春林， 艾健

（1.云南中醫藥大學，云南昆明 650500；2.云南中醫藥大學附屬云南省中醫醫院，云南昆明 650500）

在運動損傷中，35%～55%是軟組織損傷[1]。一般認為，急性損傷后的24 h內不可以熱敷，只能冰敷[2]，冰敷可以消腫止痛[3]，熱敷會加重腫脹[4]。也有研究認為，冰敷雖然會減少炎癥反應[5，6]，但同時也會減慢損傷組織的修復速度[7]。中醫傳統外治療法中沒有冰敷的概念，多強調熱敷療法。但是不論是冰敷還是熱敷，關于兩者的作用原理都缺少可靠的實驗證據，為此本課題組設計了動物實驗，以探究冰敷、熱敷在急性骨骼肌損傷后的應用效應及機理，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 30只6月齡雄性新西蘭家兔，體質量（2.66±0.21）kg，由昆明楚商科技有限公司提供，生產許可證號：SCXK（滇）K2018-0001。家兔常規分籠飼養，每籠2只，均以標準嚙齒動物飼料喂養，自由飲水。室溫保持在20～25℃，相對濕度50%～55%，光照及黑暗的環境各12 h。

1.2 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；TaKaRa PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa公司，批號：DRR036A）；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，批號：DRR820A）。Thermo NanoDrop超微量核酸蛋白檢測儀（美國Thermo Scientific公司）；Veriti型ABI PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；MX3000P型安捷倫核酸擴增熒光檢測儀（美國安捷倫公司）；RM2245半自動輪轉式切片機（德國Leica公司）。

1.3 動物分組與造模 將30只新西蘭家兔隨機分為空白組、損傷對照組、冰敷+推拿組、熱敷+推拿組、推拿組等5組，每組6只。除空白組外，其他各組家兔均造成急性骨骼肌損傷模型。參照胡軍等[8]的家兔骨骼肌鈍挫傷模型方法，本研究進行了改良。具體操作方法：將家兔右下肢腓腸肌的肌腹處用8%硫化鈉脫毛劑脫毛后，固定在兔盒內，再將右下肢固定在造模打擊臺上，在家兔腓腸肌最高點處用記號筆標記“+”號，用重力錘對準標記從高處自由落體造成打擊傷。打擊物質量為500 g，下落高度為50 cm，連續打擊3次。為減少誤差，所有造模均由同一人完成。

1.4 干預方法 為盡量保證手法的統一性，參與手法干預的人員為1名有10年工作經驗的推拿醫生，采取分批造模和取材。

1.4.1 冰敷+推拿組 傷后立刻行冰敷治療：將碎冰塊包在密封塑料袋內，置于受傷的軟組織局部，5 min后拿去，共敷3 d。第3天冰敷后開始推拿治療：先用按揉法作用于家兔委中穴1 min，而后在損傷的部位按揉法操作10 min。自第4天起，該組家兔只進行推拿干預，不再使用冰敷療法。推拿治療為每天1次，推拿至第13天。

1.4.2 熱敷+推拿組 傷后立刻行熱敷治療：將毛巾放在智能調溫煮水器中，溫度調到50℃，煮2 min，用鑷子拿出后擰干水分，將其置于家兔受傷部位，持續敷100 s，拿去該熱敷巾，立刻換上新的熱敷巾，以同樣方法重復操作3次，共計5 min。熱敷共3 d。第3天熱敷后緊接著開始做推拿干預治療，推拿干預手法同冰敷+推拿組，推拿至第13天。

1.4.3 推拿組 傷后72 h，在損傷的部位用按揉法操作10 min，每天1次，推拿至第13天。

1.4.4 損傷對照組 傷后不做任何手法治療，每天測量家兔體質量、腫脹度，到第14天取材。

1.4.5 空白組 不做任何干預，飼養14 d后取材。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 測量腫脹度 鈍挫傷后1～3 d，在做冰敷或熱敷之前（第1天即傷后30 min，第2、3天于相同時間），用細軟皮尺以“+”號為中心繞其一周測量，記錄周長讀數。做完冰敷或熱敷后，再次測量同一部位周長。腫脹度=冰敷或熱敷前下肢周長-冰敷或熱敷后下肢周長。為了盡量減少測量誤差，共測量3次取平均值。

1.5.2 體質量與腓腸肌濕質量比 取材前用電子稱稱取家兔體質量。而后經耳緣靜脈注入10 mL空氣致栓塞死亡后即刻取損傷側腓腸肌，在電子稱上稱取質量并記錄。把腓腸肌受傷最明顯處作為最佳取材部位，取約黃豆大小2塊，一塊放入體積分數10%中性福爾馬林溶液中固定，另一塊放入凍存管密封后放進液氮罐。待所有家兔取材完成后統一對樣本進行測試。

1.5.3 腓腸肌組織病理 將腓腸肌組織修切成小塊放入體積分數10%中性福爾馬林溶液中固定，然后進行包埋、切片、蘇木素—伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察腓腸肌組織病理變化。

1.5.4 逆轉錄實時定量PCR（RT-PCR）法檢測胰島素樣生長因子1（IGF-1）和成肌調節因子（MyoD）mRNA表達 稱取適量腓腸肌組織，加入1 mL TRIZOL試劑冰上勻漿后，按照總RNA提取試劑盒說明書方法進行操作。總RNA提取完后，于超微量核酸蛋白檢測儀測定所提取RNA的濃度、純度[顯示D（260 nm）/D（280 nm）在 1.8～2.0 之間]。取總 RNA 1 μg，按照TaKaRa公司RT-reagent逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應。反應體系為PrimeScript RT Master Mix 2 μL，500 ng樣本對應的總RNA體積，加ddH2O至10 μL，反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq熒光定量試劑說明書進行熒光定量PCR反應，以SYBR Green為熒光標記物，β-actin為內參對照。取2 μL cDNA加入20 μL反應體系進行擴增，反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL，Primer F 1 μL。Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s；62℃20 s。共40個循環。擴增反應結束后關閉儀器，分析數據。MYOD1引物序列：上游，5’-CTCCGAGACGTGGACTTGA-3’；下游，5’-CAGA TCCGAGGAGTCGAAAC-3’。 擴 增 長 度 99 bp。IGF-1引物序列：上游，5’-ATTTCAACAAGCCC ACAGGA-3’；下游，5’-GCCTCCTCAGATCACAG CTC-3’。擴增長度99 bp。GAPDH引物序列：上游，5’-CTCCTGCGACTTCAACAGTG-3’；下游，5’-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3’。擴增長度99 bp。擴增反應完成后，結果采用相對定量法2-ΔΔCt，計算各基因相對表達量（p）。

1.6 統計方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模結果 造模后的家兔下肢均腫脹明顯，皮下有明顯瘀青。第2天任取1只，經耳緣靜脈注入空氣栓塞處死后即刻取材，經HE染色處理后，結果顯示，和正常家兔腓腸肌組織比較，造模組家兔有明顯的肌纖維斷裂、腫脹，間質中滲出大量紅細胞、炎癥細胞，部分肌絲破壞損傷，炎癥細胞浸潤。表明造模成功。結果見圖1。

2.2 冰敷、熱敷家兔第1～3天下肢腫脹度比較 造模后的1～3 d，結果顯示：冰敷家兔第1天下肢腫脹度較熱敷組、損傷對照組增加（P＜0.05），第2、3天下肢腫脹度與其他2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。熱敷家兔第1天下肢腫脹度無變化，第2、3天腫脹度稍增加，但與其他2組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。表明冰敷在損傷早期的確有消腫的作用，熱敷則沒有加重損傷早期骨骼肌的腫脹度。

圖1 傷后第2天家兔腓腸肌組織病理變化（HE染色，×20）Figure 1 The changes of the pathological features of rabbit gastrocnemius tissues on the second day after injury（by HE staining，×20）

表1 冰敷、熱敷第1～3天家兔下肢腫脹度比較Table 1 Comparison of the swelling degrees of rabbit lower limbs during 1-3 day（s）of ice compress and hot compress （±s，l/mm）

表1 冰敷、熱敷第1～3天家兔下肢腫脹度比較Table 1 Comparison of the swelling degrees of rabbit lower limbs during 1-3 day（s）of ice compress and hot compress （±s，l/mm）

①P＜0.05，與損傷對照組比較；②P＜0.05，與熱敷+推拿組比較

第3天0.0±0.0 0.2±0.1 0.1±0.0組別損傷對照組冰敷+推拿組熱敷+推拿組N666第1天0.0±0.0 0.8± 0.0①②0.0±0.0第2天0.0±0.0 0.0±0.0 0.1±0.1

2.3 各組家兔體質量與腓腸肌濕質量比 該比值可反映腓腸肌后期恢復情況，比值越小說明腓腸肌恢復得越好。表2結果顯示：與推拿組比較，熱敷+推拿組體質量與腓腸肌濕質量比減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白組比較，損傷對照組、推拿組、冰敷+推拿組、熱敷+推拿組體質量與腓腸肌濕質量比均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示單純的推拿、冰敷+推拿療法在恢復肌質量方面無明顯優勢，熱敷聯合推拿對腓腸肌質量較其他組更有一定的積極作用。

表2 各組家兔第14天體質量與腓腸肌濕質量比的比較Table 2 Comparison of the ratio of body mass to wet mass of gastrocnemius muscles in various groups on the fourteenth day （±s）

表2 各組家兔第14天體質量與腓腸肌濕質量比的比較Table 2 Comparison of the ratio of body mass to wet mass of gastrocnemius muscles in various groups on the fourteenth day （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與推拿組比較

體質量與腓腸肌濕質量比136.547±3.608 169.225±10.521①184.542±6.510①181.490±28.648①165.805± 11.573①②組別空白組損傷對照組推拿組冰敷+推拿組熱敷+推拿組N66666

2.4 各組家兔腓腸肌病理變化比較 治療后第14天取各組家兔腓腸肌組織，經HE染色，結果顯示：損傷對照組可見肌纖維明顯萎縮、壞死，肌纖維間隙變寬，炎癥反應強烈；冰敷+推拿組亦可見肌纖維明顯萎縮、壞死，肌纖維間隙變寬及強烈炎癥反應，但可見明顯的新生血管生成。熱敷+推拿組肌纖維明顯恢復，肌纖維排列緊密整齊；推拿組肌纖維間可見明顯的結締組織填充。見圖2。表明熱敷聯合推拿的方法較冷敷聯合推拿及單純的推拿更有利于家兔腓腸肌鈍挫傷的恢復。

圖2 各組家兔腓腸肌病理變化比較（HE染色，×20）Figure 2 Comparison of the pathological features of rabbit gastrocnemius tissues in various groups（by HE staining，×20）

2.5 各組家兔第14天IGF-1、MyoD mRNA表達量比較 表3結果顯示：熱敷+推拿組IGF-1 mRNA表達水平較其他各組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。熱敷+推拿組MyoD mRNA表達水平高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；熱敷+推拿組MyoD mRNA表達水平高于推拿組和冰敷+推拿組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。表明熱敷聯合推拿法在促傷后骨骼肌修復過程中IGF-1 mRNA、MyoD mRNA表達上有一定的優勢，提示這種方法促進鈍挫傷骨骼肌的修復可能優于冰敷+推拿組、單純推拿組。

表3 各組家兔第14天IGF-1、MyoD mRNA表達量比較Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of IGF-1 and MyoD in various groups on the fourteenth day （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與損傷對照組比較；③P＜0.05，與推拿組比較；④P＜0.05，與冰敷+推拿組比較

MyoD mRNA 0.485±0.303 0.831±0.390 1.083±0.858 1.183±0.493 2.579±0.959①組別空白組損傷對照組推拿組冰敷+推拿組熱敷+推拿組N66666 IGF-1 mRNA 0.208±0.0471 0.823±0.468 1.571±1.111 2.373±1.876 4.846 ± 2.373①②③④

3 討論

本研究結果發現：急性期損傷后30 min，冰敷可以起到消腫作用，但是經冰敷后的家兔在后期恢復過程中無明顯優勢。急性骨骼肌損傷后熱敷治療沒有加重家兔下肢的腫脹程度，在后期恢復中似乎更利于軟組織的修復。另外，本課題組在干預過程中發現，經冰敷后的家兔腓腸肌內硬塊較多，取材時發現多為變性的軟組織。

冰敷療法在軟組織損傷方面被廣泛應用。一般認為，冰敷可以消腫止痛[9]，可以降低皮膚溫度[10]，減少組織損傷后帶來的炎癥反應[11]；但是對于該療法缺少強有力的證據[12]。Fullam等[13]對29位踝扭傷患者進行冰敷療法治療前后進行星形探足平衡測試，結果顯示冰敷后踝關節穩定性變差。Sloan等[14]觀察接受冰敷和非冰敷療法的2組急性踝扭傷患者，在腫脹消除方面沒有明顯的區別。Laba等[15]也得到了同樣的結論。Coté等[16]則認為冰敷在改善腫脹方面比熱敷有優勢。Basur等[17]觀察到冰敷聯合加壓包扎對踝關節扭傷的消腫作用優于單純加壓包扎。Hocutt等[18]分別用冰敷和熱敷用于36 h內踝扭傷的患者，發現冰敷組恢復功能的時間約為13.2 d，而熱敷組平均約為33.3 d。Takagi等[7]研究發現冰敷會延緩骨骼肌修復，會造成膠原蛋白合成增多。但Vieira Ramos等[19]通過對大鼠脛骨前肌造成類似打擊傷，發現冰敷療法可以消除腫脹。在本實驗中，家兔在損傷后30 min開始出現明顯的腫脹，此時分別用熱敷和冰敷療法，證明在傷后30 min冰敷有利于傷后下肢的消腫，但24 h后冰敷和熱敷對改善軟組織的腫脹度沒有差別；而從第14天各組HE染色病理結果可見，冰敷+推拿組促進骨骼肌修復作用弱于熱敷+推拿組。有研究指出，冰敷的作用機制是通過降低皮膚溫度，減少組織液滲出等來達到消腫作用[20]。但從干預過程中觀察發現，冰敷后家兔傷肢肌肉內硬結明顯多于其他各組，在后期取材中發現這些組織變性為結締組織，這說明冰敷療法對促進組織的炎性物質代謝吸收可能不利。Takagi等[7]研究亦發現，冰敷后的損傷肌肉內，膠原蛋白沉積多于非冰敷組，肌纖維的直徑也較非冰敷組細，生長因子TGF-β1和IGF-I的表達也滯后于非冰敷組1～2 d，提示冰敷會減慢軟組織的恢復速度。

推拿對骨骼肌損傷修復和運動后肌肉疲勞的恢復都有很大幫助[21]，這也是本研究選擇手法作為后期干預的原因。相關研究表明，治療運動創傷的方法大概有65種，其中使用最多而且療效又好的為手法治療，占34%，居于首位，總有效率為76.5%[22]。在骨骼肌急性鈍挫傷后，超早期推拿可增加膜修復蛋白dysferlin的表達，促進破裂的肌細胞膜及時修復，可能有利于損傷肌細胞的修復，從而幫助受損的骨骼肌修復[23]。推拿能影響人骨骼肌細胞中鈣離子的信號通路，從而激發損傷細胞修復的生物學效應[24]。本研究中，單純的推拿也可以較好地改善家兔下肢腫脹，但推拿聯合熱敷或冷敷療法對家兔骨骼肌的修復作用較單純的手法更有優勢。

MyoD是成肌調節因子家族中的成員之一，在胚胎發育過程中決定著干細胞向肌細胞方向定向分化。損傷后的骨骼肌再生與修復都受MyoD影響，而MyoD參與骨骼肌的激活和分化。MyoD現在被認為是作為主要的肌生成控制器，在由KAP1磷酸化介導的開/關轉換關聯中起作用。有研究表明，冰敷療法與損傷對照組相比，并不能改變骨骼肌中MyoD的表達[19]。本研究中，熱敷+推拿組在促MyoD生成方面優于冰敷+推拿組，表明在組織修復方面，熱敷可能優于冰敷，這提示冰敷在提高骨骼肌的MyoD mRNA表達方面沒有優勢，而傳統的熱敷療法可能會增加MyoD基因表達。

IGF-1主要作為內分泌激素以旁分泌/自分泌方式在靶組織中產生，IGF-1可調節細胞生長和發育，特別是在神經細胞中，促進細胞DNA合成[25]。IGF-1是單鏈多肽，由70個氨基酸組成，它在骨骼肌發育階段高水平表達，而在成熟骨骼肌中的表達水平卻很低，對細胞分化、增殖和個體生長發育起著重要的促進作用。IGF-1能增加骨骼肌的血液供應，促進骨骼肌蛋白合成，抑制肌動蛋白分解。肌肉損傷可引起IGF-1 mRNA的表達水平應激性增加，研究認為，IGF-1通過激活衛星細胞促進肌肉再生，阻止肌肉功能損傷，并對骨骼肌損傷修復起加速作用[26]。Takagi等[7]研究發現，冰敷會造成骨骼肌當中生長因子（TGF）-1和IGF-I的表達滯后1～2 d。本研究中，冰敷+推拿組家兔的IGF-1的mRNA表達低于熱敷+推拿組，表明與傳統的熱敷相比，冰敷+推拿組在促進IGF-1 mRNA的表達上沒有優勢，其他各組的IGF-1 mRNA表達也低于熱敷組，這提示早期熱敷可能會對軟組織腫脹的遠期恢復有益。

綜上所述，本研究結果提示在軟組織鈍挫傷的早期，冰敷減輕軟組織腫脹的療效是可靠的，在后期的組織恢復上并沒有明顯的優勢。因此，在針對軟組織的急性鈍挫傷后，先冰敷后熱敷后結合推拿治療可能是比較好的治療方案，相關的作用機制還要結合實驗研究來深入探索。