微型人胰島素基因載體的構(gòu)建及其在花生中的表達(dá)

仵陶　安勝軍　邵鐵梅　朱正歌　焦展　劉培　李雪

摘要：制備和培養(yǎng)含微型人胰島素基因的轉(zhuǎn)基因花生植株，從而利用轉(zhuǎn)基因花生表達(dá)微型人胰島素。首先按照植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成了修飾C肽的微型人胰島素基因（mini insulin，MI），其中胰島素B鏈通過(guò)丙-丙-賴(lài)三肽和A鏈相連接，在表達(dá)載體pBI121上構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)微型人胰島素的重組質(zhì)粒RIG。質(zhì)粒RIG經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至花生胚和去胚子葉中，抗生素篩選得到轉(zhuǎn)基因花生苗，之后利用PCR和Western-blot對(duì)轉(zhuǎn)基因花生幼葉進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，試驗(yàn)優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并且得到了轉(zhuǎn)基因花生苗;分子生物學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)果顯示，微型人胰島素基因成功轉(zhuǎn)入花生葉片基因組中，且在花生葉片中表達(dá)，其中以花生胚為外植體長(zhǎng)出的再生苗的陽(yáng)性檢測(cè)率為2.27%。目前正在探索微型人胰島素基因在花生油體中高效表達(dá)的方法，為轉(zhuǎn)基因花生規(guī)模化生產(chǎn)微型人胰島素提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè);轉(zhuǎn)基因花生;微型人胰島素;載體構(gòu)建;基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q786? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0042-05

胰島素是在1921年由加拿大人班廷和貝斯特發(fā)現(xiàn)的一種由胰臟內(nèi)的胰島β細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，由A鏈和B鏈2條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接而成。胰島素參與調(diào)節(jié)糖代謝，控制血糖平衡，可用于治療糖尿病。截至2015年，全球約有4.15億人患有糖尿病，中國(guó)和印度的糖尿病患者總數(shù)最高，分別是1.1億和6 900萬(wàn)人[1]。其中，Ⅱ型糖尿病占糖尿病發(fā)病率的90%[2-3]。有研究證明，對(duì)Ⅱ型糖尿病患者進(jìn)行短期胰島素強(qiáng)化治療，可使患者的血糖快速達(dá)標(biāo)，并且還可改善患者的胰島β細(xì)胞功能，使部分患者獲得較長(zhǎng)的緩解期[4]。自2012年至2015年，每年有150萬(wàn)～500萬(wàn)人死于糖尿病[1]，在2014年，由糖尿病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)花費(fèi)約為6 120億美元。截至2013年，各種抗糖尿病藥物有9類(lèi)，其中，胰島素和胰島素類(lèi)似物所占市場(chǎng)份額最高，治療效果也最好[5]。

現(xiàn)今人們使用的胰島素大部分都是生物合成人胰島素及其類(lèi)似物[6]。重組人胰島素制備方法主要分為5類(lèi)，包括酶促修飾法[7]，大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)法（其一是A鏈B鏈合成法，其二是胰島素原合成法）[8-9]，酵母發(fā)酵生產(chǎn)法（丹麥諾和諾德）[10-11]，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)法[12]，以及轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)法[13-16]。分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè)（轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)法）是指通過(guò)基因工程的方法，將需要的重組蛋白基因插入到植物細(xì)胞（植物本身不表達(dá)這些重組蛋白），得到轉(zhuǎn)基因植物，然后利用轉(zhuǎn)基因植物來(lái)表達(dá)重組蛋白。分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè)表達(dá)系統(tǒng)包括生物總量表達(dá)系統(tǒng)、懸浮細(xì)胞和發(fā)根培養(yǎng)系統(tǒng)、葉綠體表達(dá)系統(tǒng)、種子和油體表達(dá)系統(tǒng)、果實(shí)/蔬菜表達(dá)系統(tǒng)以及體細(xì)胞胚表達(dá)系統(tǒng)等[17]。其中，植物油體表達(dá)系統(tǒng)中將重組蛋白與油素蛋白融合表達(dá)，利用油相和水相不相溶易分開(kāi)的特點(diǎn)，在后期蛋白純化過(guò)程中可以簡(jiǎn)單快速地將重組蛋白和其他植物蛋白分開(kāi)，極大地降低后期純化成本[18]。花生（Arachis hypogaea）是我國(guó)重要的油料作物[19-22]，含油量在40%～60%，利用花生油體系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白具有很好的前景，目前這方面的研究較少。本研究探索利用轉(zhuǎn)基因花生表達(dá)重組蛋白微型人胰島素，從而為花生生產(chǎn)重組蛋白提供理論和技術(shù)上的準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

植物材料：花生品種冀花2號(hào)、冀花4號(hào)、冀花0607-5由河北農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所花生研究室惠贈(zèng)，花生品種大白沙、改良海花1號(hào)、四粒紅、拔二罐購(gòu)自玉安種業(yè)公司。

工程菌株及質(zhì)粒載體：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德生物基因技術(shù)有限公司。

試劑：卡那霉素（kanamycin）和鏈霉素（streptomycin）購(gòu)自Roche公司。培養(yǎng)基所用的無(wú)機(jī)鹽購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。所用激素購(gòu)自Solarbio公司。連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。2×EasyTaq PCR SuperMix （+dye）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。蛋白檢測(cè)一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，檢測(cè)二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，按照植物偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)合成了修飾C肽的微型人胰島素基因（mini insulin，MI），其中胰島素B鏈通過(guò)丙-丙-賴(lài)三肽和A鏈相連接（參考國(guó)際專(zhuān)利WO2004/111244）。在表達(dá)載體pBI121上構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒CAMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)微型人胰島素的序列。其中水稻信號(hào)肽RiceαAmy3SP和微型人胰島素融合基因由公司合成，在水稻信號(hào)肽和微型人胰島素之間添加胰蛋白酶識(shí)別序列Klip27。將融合基因所在質(zhì)粒和PBI121質(zhì)粒同樣用BamH Ⅰ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收，然后加入DNA Ligation Kit LONG進(jìn)行連接反應(yīng)，4 ℃連接過(guò)夜。第2天取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后均勻涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，通過(guò)抗生素篩選，挑取長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定正確的菌液送去北京中科希林測(cè)序部進(jìn)行DNA測(cè)序。最終測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為RIG。質(zhì)粒RIG結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

對(duì)重組質(zhì)粒RIG進(jìn)行PCR鑒定所用引物見(jiàn)表1。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳體系的建立及優(yōu)化

1.2.2.1 農(nóng)桿菌侵染花生去胚子葉的誘導(dǎo)和分化 采用液氮凍融法將RIG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。

1.2.2.2 去胚子葉的遺傳轉(zhuǎn)化 參考耿麗麗的方法[23]略有改動(dòng)。選用花生品種冀花2號(hào)、冀花4號(hào)、冀花0607-5、大白沙、改良海花1號(hào)。花生去殼后，將花生種子先置于75%乙醇中1 min，然后放入0.1%氯化汞中8 min，之后滅菌水洗4次，置于無(wú)菌濾紙上晾干;用無(wú)菌手術(shù)刀將花生2張子葉分開(kāi)去胚后，將去胚子葉放在含噻苯隆的無(wú)菌蒸餾水中浸泡。棄含有噻苯隆的無(wú)菌蒸餾水，再用干凈的無(wú)菌水洗3次。將已活化的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌液離心，4 000 r/min，5 min。棄上清后用等體積的無(wú)菌水重懸菌體沉淀，然后將花生去胚子葉浸泡于重懸液中，過(guò)夜侵染。第2天用無(wú)菌水清洗花生去胚子葉3次后，再將去胚子葉正置放于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d。2 d后，將去胚子葉轉(zhuǎn)到含50 mg/L卡那霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，約2周后外植體上產(chǎn)生抗性芽;將抗性芽轉(zhuǎn)移到含30 mg/L卡那霉素的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，約2周不定芽伸長(zhǎng);將伸長(zhǎng)的誘導(dǎo)芽轉(zhuǎn)到含30 mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基上，2周左右生根，有一些生根較遲緩;將生根的小苗進(jìn)行煉苗，然后移栽到含營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

1.2.2.3 去胚子葉非轉(zhuǎn)基因 花生去殼消毒后用無(wú)菌手術(shù)刀將花生2張子葉分開(kāi)并去掉胚，將去胚子葉正置放在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，2周后誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽;將產(chǎn)生不定芽的花生外植體繼代，轉(zhuǎn)移到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，約2周左右，不定芽發(fā)生伸長(zhǎng);將伸長(zhǎng)的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，2周左右生根;將生根的小苗進(jìn)行煉苗，然后移栽到含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

1.2.2.4 空白對(duì)照組處理 花生去殼消毒后，在無(wú)菌條件下用手術(shù)刀分開(kāi)花生子葉并去掉胚，之后將去胚子葉正置于MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.2.5 農(nóng)桿菌侵染花生胚的誘導(dǎo)和分化 （1）花生胚轉(zhuǎn)基因RIG。選用花生品種冀花2號(hào)，花生種子去殼消毒后，用滅菌刀將花生胚切下后放在農(nóng)桿菌（使用含RIG質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，搖菌培養(yǎng)至菌液吸光度D=0.6）菌液中侵染15～30 min，之后無(wú)菌水洗4次，共培養(yǎng)4～6 d后，轉(zhuǎn)到含頭孢的抑菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周，1周后分別轉(zhuǎn)到含卡那霉素（50 mg/L）和頭孢（300 mg/L）的培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上進(jìn)行光培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因花生幼苗長(zhǎng)到2.5 cm左右后轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基使其生根（頭孢300 mg/L，卡那霉素30 mg/L）。生根后將花生苗煉苗后移栽至含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（體積比2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。（2）花生胚非轉(zhuǎn)基因。選用花生品種冀花2號(hào)，種子去殼消毒后，無(wú)菌條件下用滅菌刀將花生胚切下，分別置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上進(jìn)行光培養(yǎng);之后轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基使其生根。生根后將花生苗煉苗后移栽至含有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的體積比為2 ∶ 1）的花盆中，溫室培養(yǎng)。

所用到的培養(yǎng)基見(jiàn)表2。

1.2.3 花生轉(zhuǎn)化苗的PCR鑒定 當(dāng)花生轉(zhuǎn)化苗長(zhǎng)大后，剪取花生新鮮葉片，SDS法提取葉片基因組后使用2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）進(jìn)行PCR反應(yīng)。檢測(cè)mini insulin基因的引物見(jiàn)表1，mini insulin基因長(zhǎng)度為355 bp。

1.2.4 花生轉(zhuǎn)化苗的SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè) 使用Tris-HCl法提取花生新鮮葉片的全蛋白，之后對(duì)提取的花生葉片全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western-blot檢測(cè)。共制備2塊膠，所用分離膠濃度是12%，濃縮膠濃度是4%，一塊膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)快速染液進(jìn)行染色處理，另一塊膠跑完電泳后，使用PVDF膜利用半干式轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST洗膜，4次/10 min，之后用5%奶粉溶液孵育2 h進(jìn)行封閉處理。加入1 ∶ 1 000封閉液稀釋的鼠抗人insulin一抗，室溫慢搖 30 min 后，4 ℃過(guò)夜。第2天取出雜交盒，室溫慢搖2 h，TBST洗膜，5次/10 min，加入1 ∶ 5 000封閉液稀釋的山羊抗鼠二抗，室溫慢搖2 h后，TBST洗膜，5次/10 min。進(jìn)入暗室進(jìn)行曝光處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒RIG的鑒定 使用引物RIF和CX35S-GUSR（表1）對(duì)構(gòu)建好的質(zhì)粒RIG進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn) 圖2-A。2條引物覆蓋區(qū)域包括mini insulin的序列，目的基因長(zhǎng)度為355 bp。使用內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Sac Ⅰ對(duì)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒RIG進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2-B所示。重組質(zhì)粒RIG經(jīng)雙酶切后獲得大片段約為11 kb，小片段約為 3.3 kb，小片段是35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)包括融合基因和GUS在內(nèi)的總序列，酶切結(jié)果與預(yù)期相符，說(shuō)明融合基因已克隆到載體PBI121上，之后的DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒RIG構(gòu)建成功，可以進(jìn)行下一步的花生轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

2.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳體系的建立及優(yōu)化

2.2.1 去胚子葉的遺傳轉(zhuǎn)化

2.2.1.1 轉(zhuǎn)基因去胚子葉 將花生消毒去胚后，用無(wú)菌刀片將2張子葉分開(kāi)，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后正置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約2周后發(fā)現(xiàn)部分去胚子葉長(zhǎng)出簇狀芽，繼續(xù)生長(zhǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)簇狀芽在伸長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)有部分發(fā)褐枯萎，有的去胚子葉的簇狀芽會(huì)停止伸長(zhǎng)，有的去胚子葉一部分芽枯萎，剩余芽伸長(zhǎng)長(zhǎng)成完整植株。去胚子葉轉(zhuǎn)基因花生苗移栽后，發(fā)現(xiàn)其比非轉(zhuǎn)基因花生苗要矮小（圖3-A、圖3-B）。

2.2.1.2 非轉(zhuǎn)基因去胚子葉 將花生消毒去胚后，用無(wú)菌刀片將2張子葉分開(kāi)，正置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約2周后發(fā)現(xiàn)部分去胚子葉長(zhǎng)出簇狀芽和小葉，繼續(xù)生長(zhǎng)后，簇狀芽和小葉部分有變褐枯萎現(xiàn)象，需要進(jìn)一步探索原因（圖3-C）。

2.2.1.3 空白對(duì)照 將花生去胚后，用無(wú)菌刀片將2張子葉分開(kāi)，正置于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行光培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)2個(gè)月生長(zhǎng)后，1/2去胚子葉一直未誘導(dǎo)出芽（圖3-D、圖3-F）。圖3-D、圖3-E中所用外植體品種分別是改良海花1號(hào)、大白沙;圖3-F中是冀花2號(hào)、冀花4號(hào)、冀花0607-5。

2.2.2 花生胚的遺傳轉(zhuǎn)化

2.2.2.1 轉(zhuǎn)基因花生胚 將花生胚消毒并進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染后置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上生長(zhǎng)，待小苗長(zhǎng)至約2.5 cm高時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，觀察其生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程，最終花生胚全部可以長(zhǎng)成完整植株。

2.2.2.2 非轉(zhuǎn)基因花生胚 將花生胚消毒后直接置于培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基D上生長(zhǎng)，待小苗長(zhǎng)至約2.5 cm高時(shí)轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，觀察其生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程，最終花生胚全部可以長(zhǎng)成完整植株。

2.3 花生轉(zhuǎn)化苗的PCR鑒定

SDS法提取花生葉片基因組DNA，利用上下游引物RIF和CX35S-GUSR對(duì)基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)，目的基因長(zhǎng)度是355 bp。從圖4中可知，一共獲得了6株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，分別是4號(hào)、13號(hào)、18號(hào)、19號(hào)、21號(hào)、24號(hào)，其中4號(hào)、13號(hào)、18號(hào)、19號(hào)、21號(hào)是由農(nóng)桿菌侵染花生胚誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)基因花生苗，24號(hào)是由農(nóng)桿菌侵染花生去胚子葉誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)基因花生苗。

2.4 花生轉(zhuǎn)化苗的SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)

2.4.1 SDS-PAGE檢測(cè) 融合蛋白（水稻信號(hào)肽+微型人胰島素+GUS）大小約為76 ku（圖5）。非轉(zhuǎn)基因花生植株樣品上樣量分別是10 μL（nt1）和20 μL（nt2），二者在目標(biāo)區(qū)域未出現(xiàn)條帶。4號(hào)轉(zhuǎn)基因植株上樣量為5（4a）、10（4b）、20 μL（4c）;24號(hào)轉(zhuǎn)基因植株上樣量為5（24a）、10（24b）、20 μL（24c）。4號(hào)和24號(hào)轉(zhuǎn)基因苗在76 ku處有條帶，非轉(zhuǎn)基因苗此處無(wú)條帶，為了確定人胰島素是否在轉(zhuǎn)基因花生中表達(dá)，還需對(duì)轉(zhuǎn)基因花生植株進(jìn)行Western-blot鑒定。

2.4.2 Western-blot檢測(cè) 圖6-A中，所有轉(zhuǎn)基因花生葉片總蛋白上樣量都是30 μL，其中轉(zhuǎn)基因植株4號(hào)和24號(hào)出現(xiàn)明顯條帶，大小正確，4號(hào)是用農(nóng)桿菌侵染花生胚得到的轉(zhuǎn)基因植株，24號(hào)是用農(nóng)桿菌侵染花生去胚子葉得到的轉(zhuǎn)基因植株，兩者都出現(xiàn)了條帶。正對(duì)照胰島素標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)的條帶約在5.8 ku處。圖6-B中，非轉(zhuǎn)基因花生植株樣品上樣量分別是10（nt1）、20 μL（nt2）。4號(hào)轉(zhuǎn)基因花生植株樣品上樣量分別是5（4a）、10（4b）、20 μL（4c）;24號(hào)轉(zhuǎn)基因花生植株樣品上樣量分別是5（24a）、10（24b）、20 μL（24c）;胰島素標(biāo)準(zhǔn)品上樣量是5 μL。非轉(zhuǎn)基因樣品未出現(xiàn)條帶，胰島素標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)的條帶在5.8 ku左右，24號(hào)樣品在目標(biāo)區(qū)間出現(xiàn)條帶，4號(hào)樣品則不明顯，可能是由于胰島素分子發(fā)生聚合作用導(dǎo)致單體胰島素濃度降低。4號(hào)和24號(hào)樣品在130 ku以上區(qū)域均出現(xiàn)條帶，推測(cè)可能是有蛋白質(zhì)聚合現(xiàn)象[24]。

3 討論與結(jié)論

3.1 表達(dá)載體中信號(hào)肽的作用

在植物表達(dá)載體RIG中，添加了水稻信號(hào)肽序列。根據(jù)1975年Blobel和Sabatini等提出的信號(hào)肽假說(shuō)，分泌性蛋白N端序列作為信號(hào)肽，指導(dǎo)分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成，在蛋白合成結(jié)束之前信號(hào)肽被切除。現(xiàn)已確認(rèn)， 指導(dǎo)分泌蛋白在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的決定因素是蛋白質(zhì)N端的信號(hào)肽，信號(hào)識(shí)別顆粒以及位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號(hào)識(shí)別顆粒受體。Chen等進(jìn)行的功能性分析證明，水稻淀粉酶信號(hào)肽序列可使水稻淀粉酶在葉綠體、淀粉體、細(xì)胞壁、葉子細(xì)胞外小室和懸浮細(xì)胞中表達(dá)[25]，試驗(yàn)中，選用了水稻淀粉酶的信號(hào)肽序列來(lái)引導(dǎo)微型人胰島素在植物中表達(dá)，一方面確保微型人胰島素可

以準(zhǔn)確進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行合成和修飾，另一方面，觀察其在葉片中的表達(dá)情況，以利于以后進(jìn)行在植物懸浮細(xì)胞中表達(dá)。

3.2 植物器官再生體系的建立

本研究中分別采用了花生去胚子葉和花生胚作為外植體，通過(guò)培養(yǎng)和篩選從而直接從植物器官再生出了轉(zhuǎn)基因花生苗，而未經(jīng)過(guò)愈傷組織再生生成轉(zhuǎn)基因苗。這樣做的優(yōu)勢(shì)是：培養(yǎng)周期短，無(wú)需經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)和分化階段，大大縮短了培養(yǎng)周期;在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中，可能會(huì)引起體細(xì)胞無(wú)性系變異，而由植物器官直接再生可以較好地避免這一點(diǎn)，從而提高遺傳穩(wěn)定性。但器官直接再生體系得到的轉(zhuǎn)基因苗是嵌合體植株，需要加大篩選和檢測(cè)力度[26]。

3.2.1 農(nóng)桿菌侵染去胚子葉的誘導(dǎo)和分化 參考耿麗麗的花生去胚子葉轉(zhuǎn)基因方法[23]，選用5種花生品種進(jìn)行試驗(yàn)，其中包括冀花2號(hào)花生種子15粒、冀花4號(hào)花生種子5粒、冀花0607-5花生種子5粒、大白沙花生種子15粒、改良海花1號(hào)花生種子6粒，最終獲得2株轉(zhuǎn)基因苗，這2株轉(zhuǎn)基因苗來(lái)源是冀花2號(hào)花生種子和大白沙花生種子。冀花2號(hào)花生種子中有3個(gè)去胚子葉發(fā)芽，最終只有1個(gè)去胚子葉長(zhǎng)出轉(zhuǎn)基因花生苗，另2個(gè)去胚子葉長(zhǎng)出的芽最終枯萎無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)，大白沙花生種子中只有1個(gè)去胚子葉發(fā)芽并最終長(zhǎng)成轉(zhuǎn)基因花生苗，改良海花1號(hào)花生種子中有1個(gè)去胚子葉有發(fā)芽趨勢(shì)，但最終枯萎未長(zhǎng)成，其余的或是沒(méi)有誘導(dǎo)出芽或是芽較小無(wú)法繼續(xù)伸長(zhǎng)。所以冀花2號(hào)花生種子和大白沙花生種子較適合用去胚子葉轉(zhuǎn)基因法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。2株轉(zhuǎn)基因苗中有1株（24號(hào)，來(lái)源于冀花2號(hào)花生）的基因組PCR檢測(cè)陽(yáng)性，之后全蛋白提取物經(jīng)由Western-blot檢測(cè)后出現(xiàn)目的條帶，有1株（25號(hào)，來(lái)源于大白沙花生）的PCR檢測(cè)和Western-blot檢測(cè)皆未出現(xiàn)目的條帶，可能是嵌合體的原因。利用此方法長(zhǎng)出的簇狀芽和簇狀葉會(huì)出現(xiàn)發(fā)褐枯萎現(xiàn)象，影響了轉(zhuǎn)基因苗的生長(zhǎng)，目前原因不明，需要進(jìn)一步探索。轉(zhuǎn)基因RIG組總共用了46粒花生，共92個(gè)外植體，其中有2個(gè)外植體成苗，2株苗里有1株P(guān)CR檢測(cè)和Western-blot都呈陽(yáng)性。

3.2.2 農(nóng)桿菌侵染花生胚的誘導(dǎo)和分化 用此方法共得到44株轉(zhuǎn)基因花生苗，其中，共有5株轉(zhuǎn)基因花生苗的葉片基因組經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)顯示陽(yáng)性，只有1株苗（30號(hào)）的全蛋白提取物經(jīng)Western-blot檢測(cè)出現(xiàn)目的條帶，陽(yáng)性檢測(cè)率為 2.27%，有關(guān)外源基因能否穩(wěn)定遺傳，正在進(jìn)一步研究中。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tucker M E. IDF Atlas：about 415 million adults worldwide have diabetes[R]. International Diabetes Federation，2015.

[2]Melmed S，Polonsky K S，Larsen P R，et al. Williams textbook of endocrinology[M]. Philadelphia：Elsevier Medicine，2007：1371-1435.

[3]Shi Y，Hu F B. The global implications of diabetes and cancer[J]. Lancet，2014，383（9933）：1947-1948.

[4]蔣麗華，胡 玲. 胰島素強(qiáng)化治療對(duì)新診斷2型糖尿病患者β細(xì)胞功能及病情緩解的影響[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13（36）：4055-4057，4065.

[5]阿麗塔，劉曉婷. 全球抗糖尿病藥物研發(fā)現(xiàn)狀及市場(chǎng)分析[J]. 中國(guó)藥房，2013，24（29）：2689-2691.

[6]Aggarwal S R. Whats fueling the biotech engine—2011 to 2012[J]. Nature Biotechnology，2012，30（12）：1191-1197.

[7]姜 寧，呂 曄，陳執(zhí)中. 重組人胰島素類(lèi)似物的研究應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品與藥品，2012，14（11）：445-447.

[8]馮佑民，張友尚. 重組人胰島素研究的回顧和展望[J]. 生物工程進(jìn)展，1996，16（4）：26-32.

[9]張 冉. 利用油菜油體系統(tǒng)表達(dá)重組人胰島素原的研究[D]. 上海：上海師范大學(xué)，2010.

[10]張友尚. 胰島素生產(chǎn)的回顧與展望[J]. 食品與藥品，2008，10（1）：1-3.

[11]Thim L，Hansen M T，Norris K，et al. Secretion and processing of insulin precursors in yeast[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1986，83（18）：6766-6770.

[12]Yanagita M，Hoshino H，Nakayama K，et al. Processing of mutated proinsulin with tetrabasic cleavage sites to mature insulin reflects the expression of furin in nonendocrine cell-lines[J]. Endocrinology，1993，133（2）：639-644.

[13]Nykiforuk C L，Boothe J G，Murray E W，et al. Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds[J]. Plant Biotechnology Journal，2006，4（1）：77-85.

[14]Markley N，Nykiforuk C，Boothe J，et al. Producing proteins using transgenic oilbody-oleosin technology[J]. Biopharm International，2006，19（6）：34-47.

[15]Siloto R M，F(xiàn)indlay K，Lopez-Villalobos A，et al. The accumulation of oleosins determines the size of seed oilbodies in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2006，18（8）：1961-1974.

[16]張 昱，張小平，趙凌俠. 利用煙草表達(dá)重組人胰島素原的初步研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2010，28（1）：14-18，52.

[17]張丹鳳，余自青，吳鎖偉，等. 植物生物反應(yīng)器在分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2016，36（1）：86-94.

[18]曲 勍，李校堃，于雅琴. 利用油體表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源重組蛋白[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2007，27（8）：111-115.

[19]周曙東，孟桓寬. 中國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)種植面積變化的影響因素[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（13）：250-253.

[20]顏丙囤，侯學(xué)會(huì)，梁守真，等. 花生葉鮮生物量的高光譜估算模型[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：59-62.

[21]梁克紅，朱大洲，孫君茂，等. 品種與產(chǎn)地因素對(duì)花生營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（17）：73-76.

[22]趙會(huì)芳，張習(xí)金，張永康，等. 索氏抽提法測(cè)定花生脂肪含量的方法改進(jìn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：154-156，163.

[23]耿麗麗. 轉(zhuǎn)Bt cry8Ea1、cry8Ha1基因花生的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011：54-75.

[24]Zhang Y S，Xu Y G，Li W，et al. Preparation of animal insulin through calcium phosphate gel adsorption[C]// Modern trends in protein and enzyme research. Beijing，1993：241-243.

[25]Chen M H，Huang L F，Li H M，et al. Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells[J]. Plant Physiology，2004，135（3）：1367-1377.

[26]蔣 瀅. 基于大豆種子油體系統(tǒng)表達(dá)重組白介素IL-21的研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)師范大學(xué)，2014：32-33.孫夢(mèng)夢(mèng)，黃歡歡，沈曉芳，等. 豆制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中不同DNA提取方法的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：47-50.