鮑魚菇原生質體的制備與再生研究

李光環　索肖園　史靈燕　鄭素月　郭金英

摘要：以鮑魚菇為材料，擬研究穩滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡對原生質體產量及再生率的影響。結果表明，原生質體制備的優化條件是取菌齡為10 d、液體靜置培養的菌絲0.04 g，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h，獲得原生質體的產量為1.2×107個/mL。在優化條件下得到的原生質體再生率達到 0.30%;對再生菌落進行鏡檢發現，無鎖狀聯合的原生質體單核菌株菌絲潔白，長勢旺盛，超過了雙核菌絲的長速。研究結果可以為鮑魚菇原生質體融合選育新品種提供一定的基礎。

關鍵詞：鮑魚菇;原生質體;制備;再生;單核體

中圖分類號： S646.1+41.04+3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0111-02

鮑魚菇（Pleurotus abalonus）子實體肥大，風味似鮑魚，清香脆嫩，是食藥兼用的珍稀食用菌之一。利用多種原料在夏季栽培鮑魚菇，可以彌補冀中南地區夏季鮮菇產品缺乏的狀況。此外，通過選育鮑魚菇的新品種可以逐步解決冀中南地區夏季鮮菇的供應問題[1]。

原生質體技術是近年來迅速發展起來的細胞生物工程育種新技術，原生質體的制備與再生是原生質體育種技術的基礎[2]。迄今，國內外許多學者已經從60多種食用菌中成功制備出原生質體，并對原生質體的育種技術進行了大量探索。研究發現，在金針菇[3]、香菇[4]、白靈菇[5]中都有少量單核原生質體被分離出來。潘迎捷等研究發現，單核化現象在平菇、香菇、鳳尾菇、金針菇等異宗結合的食用菌中非常普遍[6]。單核體是異宗結合食用菌雜交育種的基本材料，在食用菌育種中具有明顯的開拓性。目前關于鮑魚菇原生質體制備及再生的研究鮮有報道，本研究擬探索鮑魚菇原生質體制備及再生條件，并在優化條件下制備獲得原生質體優良單核菌株，旨在為鮑魚菇原生質體融合選育新品種提供重要的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 鮑魚菇，為筆者所在實驗室保存的菌株。

1.1.2 供試培養基及試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）綜合培養基;0.6 mol/L蔗糖再生培養基;0.6 mol/L甘露醇再生培養基;溶壁酶，購自廣東省微生物研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲培養 用PDA綜合培養基活化菌絲，研磨后置于50 mL液體PDA培養基中，于25 ℃黑暗靜置培養。

1.2.2 原生質體的制備 在無菌操作條件下將培養的菌絲過濾收集，先后用無菌水、穩滲劑分別漂洗離心（5 000 r/min，6 min）2次。將洗滌好的菌絲用濾紙吸干水分并稱質量，采用單因素試驗分別研究穩滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡等因素對原生質體產量的影響。將菌絲放入預熱的酶解液中，置于30 ℃水浴鍋中酶解，每隔10 min搖動1次，使酶解液和菌絲充分接觸，從而加快酶解速度。在酶解過程中定時取酶液置于血球計數板上鏡檢觀察原生質體的釋放情況。酶解終止后用無菌脫脂棉過濾除去殘留菌絲，將濾液于 4 000 r/min 離心10 min，棄清液，收集沉淀，用穩滲劑適當稀釋后得到純化的原生質體懸液。

1.2.3 原生質體的再生 原生質體用穩滲劑稀釋至適宜濃度，設置3個濃度梯度，每個梯度取0.1 mL原生質體懸液涂布于再生培養基平板上，于25 ℃遮光培養。獲取再生菌落，觀察計數，計算再生率。以不加穩滲劑的PDA平板作對照，再生率的計算公式如下：

再生率=（再生培養基上生長的菌落數-PDA培養基上生長的菌落數）/接種數×100%。

1.2.4 原生質體再生菌落的鑒定 將涂布于再生培養基上的原生質體進行遮光培養，肉眼可觀察到星芒狀或點狀的再生菌落，挑選再生菌落于試管斜面培養基中培養，鏡檢，根據有無鎖狀聯合確定是單核還是雙核菌絲。

2 結果與分析

2.1 原生質體制備條件

2.1.1 穩滲劑種類對原生質體產量的影響 分別以 0.6 mol/L 甘露醇、蔗糖為穩滲劑（酶濃度為2%），于30 ℃酶解3 h，每隔0.5 h取樣測定原生質體產量。由圖1可以看出，酶解開始時，原生質體隨著酶解的進行逐漸釋放，原生質產量逐漸上升直至達到峰值，以甘露醇作為穩滲劑酶解1.5 h時，原生質體產量高于以蔗糖作為穩滲劑的，隨后低于以蔗糖作為穩滲劑的，以甘露醇作為穩滲劑處理的原生質體產量在1.5 h時達到峰值1.1×107個/mL，以蔗糖作為穩滲劑處理的原生質體產量在2.0 h時達到峰值1.0×107個/mL。2.0 h 后，酶活性逐漸降低，且原生質體隨著酶解時間的延長會破裂，原生質體產量呈下降趨勢。

2.1.2 菌絲量對原生質體產量的影響 分別稱取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g菌絲放入以0.6 mol/L蔗糖作為穩滲劑的無菌酶解液中（酶濃度為2%），于30 ℃酶解2 h后，檢測原生質體產量。由圖2可以看出，0.04 g菌絲量的原生質體產量最高，達到9.5×106個/mL，之后隨著菌絲量的增加，原生質體產量出現了下降趨勢。

2.1.3 酶解時間對原生質體產量的影響 取菌絲置于以06 mol/L蔗糖作為穩滲劑的無菌酶解液中，于30 ℃酶解1、2、3、4 h，在不同時間取樣測定原生質體產量。圖3結果表明，在1～2 h之間，原生質體產量隨著酶解時間的延長而迅速增加，在2 h時酶解所得原生質體產量最高，為1.1×107個/mL，隨后原生質體產生量逐步下降，由此可見，制備鮑魚菇的原生質體酶解時間以2 h為宜。

2.1.4 菌齡對鮑魚菇原生質體產量的影響 分別取培養6、8、10、12、14 d的菌絲體，在以0.6 mol/L蔗糖為穩滲劑的無菌酶解液中于30 ℃酶解2 h，檢測原生質體的產量。由于鮑魚菇菌絲較其他側耳屬品種生長速度慢，培養的前5 d菌絲量較少，因此不適合用于制備原生質體。圖4結果表明，從培養6 d開始，隨著菌齡的增加，原生質體產量開始遞增，培養10 d時的原生質體產量為1.20×107個/mL，到培養12 d時，原生質體產量最高，達到1.38×107個/mL，但是培養12 d以后，原生質體產生量開始明顯下降。

2.2 原生質體再生結果

2.2.1 不同穩滲劑再生培養基對原生質體再生率的影響 分別以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖作為穩滲劑，在培養12 d時，蔗糖培養基上原生質體再生率為0.30%，而甘露醇培養基只有0.05%。綜合考慮，以0.6 mol/L蔗糖再生培養基作為優選培養基。

2.2.2 不同菌齡對原生質體再生率的影響 分別選取菌齡為6、8、10、12、14 d的菌絲體，檢測原生質體的再生率。由表1可以看出，菌齡為8、10 d的原生質體再生率遠遠高于其他菌齡的，以菌齡為10 d的菌絲原生質體再生率最高，達0.30%。

2.3 原生質體再生菌落的鑒定分析

通過對再生菌落進行鏡檢發現，鮑魚菇有鎖狀聯合的雙核菌株都長有分生孢子梗束，頂部呈黑色球形，梗呈白色，而無鎖狀聯合的單核菌株菌絲潔白，呈絨毛狀，長勢旺盛。從菌絲長勢及顯微結構觀察初步看出，挑取的單核菌絲更加粗壯，經測定，單核菌絲在培養10 d時長滿直徑為90 mm的培養皿，雙核菌絲在培養16 d時長滿直徑為90 mm的培養皿，單核菌絲體在長勢和長速上均超過了雙核菌絲（圖5）。

3 結論與討論

本研究得出鮑魚菇原生質體制備的優化條件：用液體靜置培養的菌齡為10 d的0.04 g菌絲，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h， 原生質體

產量為1.2×107個/mL。在優化的條件下，得到的原生質體再生率達到0.30%。影響原生質體釋放的因素很多，本試驗通過對鮑魚菇原生質體制備條件和再生的研究，明確了在液體靜置培養的條件下，穩滲劑種類、酶解時間、菌絲量、菌齡對原生質體產量和再生的影響。本研究通過對鮑魚菇菌絲進行液體培養制備原生質體，首先對穩滲劑種類進行選擇，在本試驗中，以甘露醇作穩滲劑制備獲得的原生質體產量在酶解 0～1.5 h內高于以蔗糖作為穩滲劑的，與周霞等報道的以甘露醇作為穩滲劑制備獲得的原生質體產量高于蔗糖的研究結果[7]一致，但因以蔗糖作為穩滲劑時，再生率遠遠高于甘露醇，因而本試驗均采用蔗糖作穩滲劑。

在前人的相關研究中，原生質體單核菌絲長速一般低于雙核菌絲，本試驗選出的幾個鮑魚菇單核菌絲長速明顯快于雙核菌絲，其機制尚需進一步研究。

本研究通過對鮑魚菇原生質體制備及再生條件的初步研究，優化了其制備條件，獲得了原生質體優良單核菌株，為鮑魚菇原生質體融合選育新品種提供了重要的研究基礎。

參考文獻：

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[4]朱朝輝，陳明杰，譚 琦，等. 香菇原生質體單核體的再生與交配型的關系[J]. 食用菌學報，2000，7（4）：1-3.

[5]李 莎，劉 宇，馬 康，等. 原生質體單核化技術在白靈菇菌種提純復壯中的應用[J]. 江蘇農業科學，2015，43（5）：248-250.

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