氨氮對錦鯉相關酶活性和基因表達的影響

史東杰　朱華　張欣　王文峰　孫硯勝

摘要：以初始體質量約為（132.4±4.6） g的錦鯉為對象，研究不同氨氮濃度對錦鯉肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性與抗氧化酶基因（AchE、Cyp450）、皮膚體色基因（Tyr、Mc1r）表達的影響。結果表明，氨氮對錦鯉在24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為2.73 mg/L。氨氮暴露初期（2 d），各試驗組總SOD活性無顯著差異，暴露中后期（6、10、14 d），各試驗組總SOD活性整體上表現出先升高后降低的趨勢;在氨氮脅迫下，各試驗組CAT、AChE活性分別大致呈現先增加后降低、一直降低的趨勢;錦鯉肝臟組織中AchE基因表達量與對照相比顯著下降（P<0.05）;Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量明顯下調（P<0.05）;皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制。可以得出，隨著氨氮暴露濃度的增加和暴露時間的延長，錦鯉免疫酶活性和基因表達量均趨于降低，說明魚體免疫防御系統遭到了損傷。

關鍵詞：氨氮;錦鯉;急性毒性;基因

中圖分類號： S917? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0150-04

氨氮是水產養殖中水質檢測的重要指標之一，氨氮含量對水生動物的生長有很大的影響。尤其是現代水資源緊缺，集約化養殖積累了大量排泄廢物、殘余餌料，還有水生動物尸體，這些物質經過異養型細菌分解為蛋白質和核酸，從而產生大量含氮有害物質[1-2]。在水產養殖過程中，氮以分子態氮（N2）、無機態氮（NH3、NH4+）及有機物等形式存在，其中以無機態氮（NH3、NH4+）對養殖的危害最大，毒性最強[3]。魚類對氨氮毒性非常敏感，氨氮可降低魚類生長速度，傷害魚體組織結構、免疫功能、繁殖能力以及血液生化指標[4-6]。有學者認為，任何可以檢測出的氨氮對魚類的生長都會產生危害[7]。

錦鯉是經濟合作與發展組織（OECD）規定的5種試驗生物之一，也是我國主養的觀賞魚類。已有研究大多集中在氨氮對魚類的生長和酶活性的影響方面，很少有對魚類相關基因表達的影響研究[8-10]。本研究以錦鯉為試驗對象，以抗氧化酶和基因表達量變化為指標，同時研究氨氮暴露下對錦鯉相關體色基因表達的影響，研究氨氮對錦鯉的急性毒性作用，為氨氮生態風險評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗錦鯉，購于北京市十里河花鳥魚蟲市場。試驗魚平均體長（12.7±2.8） cm，平均體質量（132.4±4.6） g，雌雄均有，魚體健康，規格相似。暴露試驗前，將試驗魚馴化10 d，水溫（25±1） ℃，采用曝氣自來水，每天光照8～10 h，每天定時投喂顆粒飼料1次，投喂總量為魚體質量的2%～3%。養殖過程中及時換水并清除殘餌和代謝廢物。試驗魚自然死亡率<1%，試驗前24 h禁食。

氨氮儲備液：稱取氯化銨（分析純）用純凈水稀釋制成 10 g/L 的儲備液，備用。

1.2 試驗方法

試驗于2017年1月在北京市水產科學研究所小湯山良種繁育中心進行。

急性毒性試驗參照文獻[11]。

慢性毒性試驗：在96 h LC50半致死濃度下，設置8個處理濃度，分別為A（0.1×LC50）、B（0.2×LC50）、C（0.3×LC50）、D（0.4×LC50）、E（0.5×LC50）、F（0.6×LC50）、G（0.7×LC50）、H（0.8×LC50），并以曝氣純凈水為空白對照組。每個處理濃度設置3個平行，每缸25尾魚，水量100 L。每天全部換水1次，每天投喂2次，投喂總量為魚體質量的2%～3%，進行慢性毒性試驗。每個質量濃度組和對照組在放魚后的2、6、10、14 d分別取樣，用于抗氧化酶活性和基因表達的測定。

抗氧化酶活性測定：每個處理組取5尾魚，冰面解剖取肝臟組織，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分勻漿，4 ℃冷凍離心（12 000 r/min）20 min后取上清液，用于測定總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性。酶活性的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

抗氧化酶基因和體色基因表達量的測定：每個處理組取5尾魚，冰面解剖取肝臟、皮膚，液氮速凍，用TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將定量的RNA反轉合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，其間收集熒光信號。抗氧化酶基因cDNA片段擴增反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，32個循環。體色基因cDNA片段擴增反應條件：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，36個循環。所有基因序列來自GenBank，引物信息見表1。

1.3 統計分析

試驗數據用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 13.0軟件進行數據統計和分析，用多重比較法進行組間差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氨氮對錦鯉的急性毒性效應

通過急性毒性試驗，在高氨氮暴露下，錦鯉反應遲鈍，游動遲緩，魚鰭和尾部有不同程度的腐爛，鰓部紅腫且黏液增多。由表2可知，總氨氮對錦鯉在24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為2.73 mg/L。

2.2 氨氮對錦鯉肝臟抗氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響

由表3可知，錦鯉暴露于氨氮初期（2 d），各試驗組總SOD活性與對照組無顯著差異，暴露中后期（6、10、14 d），各試驗組總SOD活性存在顯著差異（P<0.05），與對照組相比，A至E組總SOD活性顯著增加，而高濃度組F至H組總SOD活性顯著降低 （P<0.05）。 錦鯉暴露于氨氮初期、 中期（2、6、10 d），各試驗組CAT活性與對照組相比顯著增加（P<0.05）;暴露后期（14 d），各試驗組CAT活性與對照組相比顯著降低（P<0.05）。錦鯉暴露于氨氮初期、中期和后期（2、6、10、14 d），錦鯉肝臟AChE活性均受到顯著限制，且隨著暴露時間、濃度的增加，AChE活性明顯降低。

2.3 氨氮對錦鯉相關基因表達的影響

氨氮對錦鯉肝臟抗氧化酶基因AchE、Cyp450和皮膚體色基因Tyr、Mc1r表達量的影響見表4，可以看出，氨氮暴露后，錦鯉肝臟組織中AchE基因表達比率與對照組相比，受到顯著限制（P<0.05），且隨著暴露時間的增加，氨氮處理濃度的提高，AChE基因表達量顯著下降（P<0.05），與酶活性測定結果基本一致。Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量顯著下調（P<0.05），說明受到了抑制。由表4可知，皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制。

3 討論

氨氮是水產養殖環境中的一種重要環境污染因子，氨氮的危害可表現為大量消耗水體溶解氧而使水中缺氧并與氯作用生成氯胺，從而增加氧的消耗量，影響魚鰓的氧傳遞，濃度較高時導致魚類死亡，同時高濃度的氨氮還有可能形成亞硝胺，可致癌、致變異和致畸，對魚體有潛在威脅，可加速水體富營養化過程[12]。氨氮對水生生物的危害主要表現為非離子氨的危害，非離子氨進入生物體內，會對酶水解反應造成破壞。許多研究表明，高濃度氨氮脅迫對水生生物的免疫具有顯著的影響，尤其是長時間高濃度脅迫會導致機體免疫力下降。例如斑馬魚[13]、羅非魚[9]、黃顙魚[14]等魚類的死亡率隨著氨氮濃度的升高和時間的延長不斷提高，這與本試驗結果一致。由本試驗可知，毒性效應與氨氮濃度和脅迫時間呈正相關。在本試驗中，氨氮對錦鯉24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為 2.73 mg/L。

超氧化物歧化酶是機體重要的抗氧化酶，它是生物體有效清除活性氧、防止活性氧合成和蓄積、阻斷脂質過氧化連鎖反應、保護細胞膜免受損傷的重要酶類之一，可反映機體免疫能力，被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線[15]。過氧化氫酶是生物體內抗氧化系統中重要的保護酶，起著催化H2O2分解、保護生物體組織免受毒害的重要作用。周瑩等研究氨氮對斑馬魚肝臟組織SOD活性的影響發現，氨氮脅迫后表現為低濃度促進、高濃度抑制的趨勢[13]。從本試驗結果可知，錦鯉受到氨氮脅迫的過程中，肝臟組織SOD和CAT活性在下降之前都有不同濃度、不同時間的上升規律，這與氨氮脅迫下斑馬魚的反應相似。分析其原因可能是當水體中氨氮濃度較高時，機體在不同濃度、不同時間氨氮作用下，機體生物免疫力增高，即產生了“毒性興奮效應”，而在本試驗后期（10、14 d）時，隨著時間的延長，錦鯉體內氨氮積累了較高的毒性，體內自由基防衛系統受到破壞，促使過氧化氫、單線態氧等濃度增加，導致酶活性迅速下降，機體免疫失衡，因此SOD和CAT活性顯著下降。在本試驗中的不同脅迫濃度、不同脅迫時間處理下，AChE活性均受到抑制，這和周瑩等報道的氨氮濃度抑制斑馬魚AChE活性[13]一致。說明氨氮濃度的增加可迅速降低AChE活性，從而使機體免疫失衡。

生物機體在受到外界刺激后，在不同水平（蛋白、基因、細胞、組織器官）上均會發生不同程度的應激反應，從而減輕或者適應污染物的壓力[16]。近年來，許多研究表明，污染物對基因表達水平的影響程度可以用來監控其毒性。Wirzinger等認為，分子水平（DNA或RNA）的指示物具有清晰、明確、特異性更強的特點，且避免了后續翻譯與修飾過程中的干擾[17]。王麗等研究高效氯氰菊酯急性暴露中斑馬魚相關酶活性和基因表達變化的影響時發現，高效氯氰菊酯會抑制斑馬魚肝臟、腸和腦中AChE和CYP450的mRNA表達量[18]。Wu等的研究發現，斑馬魚胚胎暴露于一定濃度四溴雙酚A（TBBPA）時，Cu/Zn-SOD、CAT的mRNA表達下調[19]。在本研究中，于氨氮中暴露后，錦鯉肝臟組織中AchE基因表達與對照組相比受到顯著性限制，且隨著暴露時間的增加，氨氮處理濃度的提高，AChE基因表達量顯著下降，與酶活性測定結果基本一致。Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量明顯下調，這一結果與Wu等的研究結果類似[19]。這說明在高濃度氨氮暴露下，錦鯉氧化損傷嚴重，在短時間內即可造成機體免疫失衡，產生較大的毒害作用。在本試驗中，皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制，試驗期間試驗魚體色無光澤、暗淡，也說明氨氮可顯著影響錦鯉體色。

綜上所述，本研究獲得了氨氮對錦鯉的急性毒性結果和氨氮脅迫下抗氧化基因、皮膚體色基因轉錄量的變化規律，發現氨氮對錦鯉免疫系統和體色因子有重要的損傷。綜合考慮，建議錦鯉養殖過程中氨氮濃度應不高于1.6 mg/L。

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