補正續骨丸對去卵巢大鼠骨量及其相關骨折的作用機制研究

于巖松 柳椰 那俊夫 于冬冬 楊鶇祥*

1.沈陽市骨科醫院，沈陽市骨科醫院承基醫院，遼寧 沈陽 110032 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原發性骨質疏松癥主要類型，其骨折發生率高[1]，老年PMOP在髖部及脊柱的骨質疏松性骨折5年后生存率不到60%[2]。其致死原因為患者長期臥床出現如墜積性肺炎、下肢深靜脈血栓形成等并發癥。PMOP患者骨量丟失嚴重，對內固定物把持力弱，手術失敗率高[3]。補正續骨丸在我院應用半個世紀，對骨質疏松癥有一定的療效[4-7]，但對PMOP及相關骨折的作用及機制還不清楚，本研究對補正續骨對PMOP及相關骨折的作用及潛在機制進行研究，為臨床應用該藥治療PMOP及相關骨折提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠由遼寧長生生物技術有限公司提供，共100只，均為健康雌性大鼠，體重為180±20 g，許可證：SCXK(遼)2015-0001。遼寧中醫藥大學附屬醫院動物實驗倫理委員會審核通過。

1.1.2主要實驗藥物與試劑：本實驗所用實驗藥品均源于遼寧中醫藥大學附屬醫院，補正續骨丸由沈陽金竹藥業有限公司生產，組成：首烏(制)25 g、鹿茸 15 g、煅自然銅 40 g、骨碎補 30 g、續斷 30 g、枸杞 20 g、菟絲子 15 g、香櫞、雞血藤、合歡、烏賊骨各 15 g；骨疏康顆粒由遼寧康辰藥業有效公司生產，批號：160919；接骨七厘膠囊由湖南金沙藥業有限公司生產，批號：Z20053999；雷帕霉素(分裝)由上海MKL生化科技有限公司生產，批號：K1089；阿侖膦酸鈉產于上海MKL生化科技有限公司，批號：A801267。

EDTA脫鈣液(AR1071，中國)，P1NP ELISA試劑盒(m1002251，中國)，β-CTX ELISA試劑盒(m1038002，中國)，P70S6K一抗(bs-0295G-HRP，美國)，4EBP-1一抗(bs-0885G-HRP，美國)，羊抗兔二抗(bs-0 195 A-HRP，美國)，DAB顯色試劑(KIT9710，中國)。

1.1.3實驗儀器：骨密度儀(Straros DR，法國)，光學顯微鏡(Nikon MODEL YS100，日本)，酶標儀(Infinite F50，中國)，脫水機(LEICA 300，德國)，恒溫箱(DHG-9 070 A，中國)，電熱恒溫箱(101-0-BS，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型制備及分組：大鼠稱重后采取0.7%水合氯醛溶液(5 mL/kg)腹腔麻醉，麻醉成功后，消毒、備皮，剃除大鼠背部毛發約3 cm×3cm，碘伏消毒。采取縱向切口，切口起自大鼠雙側肋下緣連線中點，長約2 cm，將切口拉向左側，于背部旁開2 cm、肋下1 cm處依次剪開筋膜、肌肉，進入腹腔，切口長約0.5 cm，暴露子宮角，組織鑷夾持卵巢，縫合線結扎子宮角，剪除卵巢、縫合線，對側操作同上。沖洗、消毒、逐層縫合。術后3日予頭孢呋辛(70 mg/kg)每日一次肌注以預防感染。術后3日每日更換墊料。摘除大鼠雙側卵巢(圖1a)，造模成功6周后，腹腔注射麻藥，采用雙能X線骨密度儀測量大鼠股骨BMD(圖1b)。結果見表1，說明造模成功。

圖1 大鼠卵巢摘除及骨密度檢查a.大鼠卵巢摘除， b.正常組、模型組、假手術組大鼠骨密度檢查Fig.1 a, area of ovariectomy in rats, b, bone mineral density scan in rats (normal group, model group, and sham operation group)

Table1BMD was measured 6 weeks after removal of the ovary

組別數量BMD/(g/cm2)正常組 100.243±0.012△模型組 800.190±0.022假手術組100.242±0.009△

注：與模型組比較，△P<0.05。

將大鼠隨機分為正常組、模型組、假手術組、中藥組(高、中、低)、骨疏康、接骨七厘膠囊、雷帕霉素組(通路抑制劑組)、阿侖膦酸鈉10組，每組10只。中藥組以常規劑量作為中劑量，高∶中∶低=2∶1∶1/2，每日2次，雷帕霉素予8 mg/(kg.2 d)腹腔注射。骨疏康、接骨七厘膠囊予人體等效劑量為0.315 g、0.038 g，正常組、模型組、假手術組予等量蒸餾水灌胃。每周稱重調整給藥量。

1.2.2骨密度儀測量大鼠股骨BMD：大鼠造模成功后，按計劃給藥6周，予腹腔麻醉后測量大鼠股骨BMD。觀察各組在用藥后BMD差別。

1.2.3HE染色觀察大鼠股骨組織形態計量學指標：取大鼠股骨組織，固定、脫水、封閉、切片。每組選擇4張完整載玻片進行HE染色，選取合適大小蓋玻片用樹膠完成封片、鏡檢。

1.2.4ELISA檢測法檢測大鼠外周血血清中β-CTX、P1NP含量的影響：抽取大鼠腹主動脈血并制備血清。在96孔板上設置標A孔為標準品孔，依次在標準品孔加入標準品濃度為0、0.5、1、2、4、8倍濃度的標準品50 μL。設置B-G行為待測樣品孔，分別為正常組、模型組、中藥組(中)、骨疏康組、阿侖膦酸鈉組、雷帕霉素組，H行為空白孔，每組12孔以保證可重復性。加稀釋液40 μL、樣品10 μL，除空白孔外，加入酶標試劑100 μL。通過標準曲線計算樣品中CTX、P1NP含量。

1.2.5免疫組化測定大鼠脛骨組織中4EBP-1、p70S6K蛋白表達：組織脫蠟成功后行抗原修復、內源性過氧化物酶封閉、非特異性抗原封閉。以試劑2作為抗原稀釋液一抗孵育，以試劑3行二抗孵育，以試劑4行過氧化物酶標記。顯色劑顯色后加入蘇木素復染。樹膠封片、鏡檢。

1.2.6Western-blot測定大鼠脛骨樣本中蛋白含量：取150 mg大鼠脛骨組織樣本，加入細胞裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備上樣蛋白、配膠。20 μg蛋白樣品進行電泳，電泳結束后調整電壓至90 V轉膜至PVDF膜上。37 ℃封閉1 h、一抗4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標記的稀釋二抗孵育。ECL發光法曝光成像，掃描入電腦。Image J軟件測定平均灰度值。

1.2.7觀察各組大鼠骨折愈合時間及骨痂密度：大鼠摘除卵巢6周后，進行骨折造模。給藥后，大鼠腹腔麻醉后測量大鼠骨痂區的骨密度及骨折骨性愈合時間。觀察各組在用藥后骨痂區密度、愈合時間的差別。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 骨密度儀測量大鼠股骨BMD

股骨骨密度：與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨密度明顯降低，P<0.05；與模型組組相比，中藥組骨密度明顯上調，P<0.05；中藥組中劑量骨密度高于高、低劑量組。

表2 給藥后各組去卵巢大鼠骨密度Table 2 BMD after drug administration

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較比較，△P<0.05；與阿侖膦酸鈉組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

圖2 給藥后各組去卵巢大鼠骨密度Fig.2 BMD after drug administration

股骨骨密度：與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨密度明顯降低，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨密度明顯上調，P<0.05，；中藥組中劑量骨密度高于高、低劑量；與阿侖膦酸鈉組相比，中藥組骨密度差異不具有統計學意義，P>0.05。

2.2 補正續骨丸對去勢大鼠股骨組織形態計量學指標的影響

通過骨組織切片染色，比較各組骨小梁數量和形態。骨組織形態顯微Mimics圖像分析:制作股骨髁部松質骨的HE染色切片后(圖3)，每個切片隨機選擇一個視野，在Mimics圖像處理與分析系統中進行骨小梁面積測量(表3)。

由圖3可見，正常組骨小梁分布均勻、連續完整。模型組、雷帕霉素組骨小梁分布稀疏，且有部分連續性中斷。中藥組骨小梁分布較模型組密集、均勻，無明顯斷裂；較骨疏康組分布均勻，斷裂少；較阿侖膦酸鈉組，骨小梁寬度增寬。

由表3、圖4可見，與正常組相比，模型組、雷帕霉素組(通路抑制劑)骨小梁面積明顯降低，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨小梁面積明顯上調，P<0.05；與阿侖膦酸鈉組相比，中藥組骨小梁面積明顯上調，P<0.05。

2.3 ELISA法檢測補正續骨丸對去勢大鼠外周血血清中β-CTX、P1NP含量的影響

根據樣品OD值計算標準曲線(圖5)。

P1NP測量結果顯示，模型組較正常組明顯降低，P<0.05。各給藥組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明中藥組對P1NP水平無明顯影響。

β-CTX測量結果顯示，正常組與假手術組差異無統計學意義(P>0.05)，與正常組比較，模型組CTX顯著升高。各給藥組與模型組比較，β-CTX水平不同程度降低(P<0.05)，說明各治療組藥物均能不同程度降低β-CTX水平。與模型組比較，中藥組β-CTX水平顯著降低，補正續骨丸高劑量組與中、低劑量組β-CTX水平差異有統計學意義。說明補正續骨丸中、低劑量組能夠降低CTX水平，補正續骨丸高劑量組對β-CTX水平影響小于中低劑量。與骨疏康組比較，補正續骨丸中、低劑量組β-CTX水平升高，說明補正續骨丸中、低劑量對β-CTX水平抑制作用強于骨疏康(見表4、圖6)。

圖3 各組骨小梁HE染色(10×10)A正常組、B模型組、C中藥中劑量組、D骨疏康組、E阿侖膦酸鈉組、F雷帕霉素組。Fig.3 HE staining of trabecular bone in each group (10×10 times)A, normal group, B, model group, C, medium-dose Chinese medicine group, D, Gushukang group, E, Alendronate group, F, rapamycin group.

Table3Ratio of trabecular bone area after drug administration

組別數量骨小梁面積比正常組100.318±0.012△模型組100.233±0.012▲中藥組中劑量100.308±0.032▲★骨疏康組100.262±0.036▲★阿侖膦酸鈉組100.208±0.029▲雷帕霉素組100.233±0.012▲●

注：與正常組比較，▲P<0.05，■P>0.05；與模型組比較，△P<0.01，●P>0.05；與西藥組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

圖4 給藥后各組骨小梁面積比Fig.4 Ratio of trabecular bone area after drug administration

圖5 β-CTX、P1NP標準曲線β-CTX標準曲線(Y=2.6769X-0.1941)P1NP標準曲線(Y=1.9714X-0.063)Fig.5 The standard curve of β-CTX and P1NP

組別β-CTXP1NP正常組3.21±0.2110.96±0.22模型組3.58±0.18▲8.44±0.68▲中藥組中劑量2.51±0.17△☆8.45±0.19△★骨疏康組3.04±0.33△☆8.89±0.61△★阿侖膦酸鈉組3.56±0.20●10.74±0.29●雷帕霉素組3.06±0.37△8.78±0.48△

圖6 大鼠外周血情中β-CTX、P1NP水平注：與正常組比較，▲P<0.05，■P>0.05；與模型組比較比較，△P <0.05，●P>0.05；與西藥組比較，★P>0.05，☆P<0.05。Fig.6 The concentration of P1NP and beta -CTX in peripheral blood of rats

2.4 WB檢測4EBP-1、p70S6K蛋白量

正常組的蛋白的相對含量為1，各實驗組與正常組進行比較，計算得出比值。與正常組比較，模型組p70S6K、4EBP1相對灰度值表達顯著升高(P<0.05)，差異具有統計學意義，說明模型對照組p70S6K、4EBP1的表達顯著升高。與模型組相比，補正續骨丸中劑量組相對灰度值降低(P<0.05)，說明補正續骨丸能夠降低p70S6K、4EBP1的表達。中藥組與雷帕霉素組比較，補正續骨丸中劑量組p70S6K、4EBP1相對灰度值升高，說明補正續骨丸中劑量對p70S6K、4EBP1抑制作用弱于雷帕霉素(圖7、表5)。

圖7 4EBP1、p70S6K蛋白表達A正常組、B模型組、C中藥中劑量組、D雷帕霉素組。Fig.7 4 EBP1,p70S6K expression from left to right, A, normal group, B, model group, C, medium-dose group, D, rapamycin group.

Table5Comparison of protein expressions of 4EBP1 and p70S6K (relative gray value)

組別4EBP1p70S6K正常組0.147±0.0120.145±0.017模型組0.418±0.072▲0.408±0.055▲補正續骨丸(中)0.308±0.033△★0.366±0.018△☆雷帕霉素組0.266±0.029△0.242±0.020△

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與雷帕霉素組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

2.5 補正續骨丸對去勢大鼠骨質疏松性骨折的影響

大鼠摘除卵巢6周后，進行骨折造模(圖8、圖9)。成功造模后，各組按計劃連續給藥6周，觀察各組在用藥后骨痂區密度、愈合時間的差別。

圖8 A、B大鼠造模操作，C股骨DR，D內固定(取出)Fig.8 A, B, rat model operation, C, femur DR, D internal fixation (taken out)

圖9 大鼠股骨骨折骨性愈合DR(箭頭標記處A未拆除內固定，B拆除內固定)Fig.9 Bone-healing DR of rat femur fractures (A internal fixation not being removed, B internal fixation being removed)

與正常組相比，模型組骨痂密度明顯降低，P<0.01；與模型組相比，中藥組骨痂密度明顯上調，P<0.05；與中藥對照組相比，中藥組骨痂密度差異不具有統計學意義，P>0.05，(表6)。

表6補正續骨丸對骨質疏松大鼠骨痂密度的影響

Table6Effect of Buzhengxug pill on osteophyte density in osteoporotic rats

組別數量BMD/(g/cm2)正常組90.218±0.012模型組80.190±0.020▲補正續骨丸(中)90.215±0.008△☆接骨七厘組90.211±0.010

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與接骨七厘組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

與正常組相比，模型組骨折愈合時間明顯延長，P<0.05；與模型組相比，中藥組骨折愈合時間明顯縮短，P<0.05，；與中藥對照組相比，中藥組骨折愈合時間差異不具有統計學意義，P>0.05，(表7)。

表7補正續骨丸對骨質疏松大鼠股骨骨折愈合時間的影響

Table7Effect of Buzhengxugu pill on the healing time of femoral fracture in osteoporotic rats

組別數量愈合時間/(d)正常組954±2.5模型組864±2.1▲補正續骨丸(中)960±1.4△☆接骨七厘組959±2.5★

注：與正常組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與接骨七厘組比較，★P>0.05，☆P<0.05。

3 討論

骨形成作用和骨吸收作用之間的動態平衡是維持骨骼健康的關鍵因素[8]。雌激素分泌減少導致的骨吸收能力增強，是絕經后骨質疏松的主要因素[9-10]。雌激素通過調節自噬而調節骨折端血管內皮及成骨細胞增殖促進骨折愈合[11]。成骨細胞分泌骨保護素亦受到雌激素調控[12]，雌激素可調節破骨細胞凋亡[13]。骨折愈合起初由破骨細胞吞噬壞死骨細胞，隨后破骨細胞通過自噬活性逐步降低，成骨細胞活性升高。

研究發現抑制 mTOR1信號通路可對成骨及破骨細胞增殖有一定的影響[14]。自噬在代謝性骨病發病中發揮重要作用[15]，與自噬影響細胞生長、存活、分化和細胞自身穩態密切相關，ROS-AKT-mTOR1信號軸在信號軸也參與調節細胞凋亡和增殖[16]。Alvarez-Garcia等[17]給4周70 g左右的雄性大鼠，腹腔注射Rapamycin [2 mg/(kg/day)]兩周，發現通過雷帕霉素抑制mTOR1通路能明顯減少生長板中破骨細胞的數量。與此同時，mTOR1通路亦可通過調節破骨細胞的數量促進軟骨生成[18]，也涉及促紅細胞生成誘導成骨[19]。

本文通過實驗證實補正續骨丸對PMOP有一定的防治作用。其能夠降低大鼠血清中β-CTX水平從而抑制骨吸收。然而，其對P1NP無明顯影響，說明補正續骨丸對骨形成無明顯影響。PMOP的發生可升高mTOR1信號通路中p70S6K、4EBP1的表達，然而我們通過實驗證實：補正續骨丸可以抑制mTOR1信號通路中p70S6K、4EBP1的表達，繼而促進骨質疏松性骨折的愈合，提升骨痂密度。

綜上所述，本研究對補正續骨丸治療PMOP及骨質疏松性骨折進行研究，結果表明補正續骨丸對PMOP及骨質疏松性骨折有一定的防治作用，并且是通過調節自噬相關mTOR1信號通路p70S6K、4EBP1的表達來抑制骨吸收來實現的，為補正續骨丸用于臨床防治PMOP提供新的理論基礎。