姜黃素對β-淀粉樣蛋白損傷神經干細胞增殖和凋亡的影響

信嘉軒 教傳華 商 華 朱雁飛 肖韓艷 李 麗 李文媛

牡丹江醫學院附屬第二醫院，黑龍江牡丹江 157001

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群中常見的一組病因未明的中樞神經系統退行性疾病，特別是對于年齡＞65 歲的老年人，女性更常見[1-3]。該病主要表現為持續的認知功能障礙以漸進性記憶障礙、認知功能喪失伴日常生活能力下降和行為改變為特征，其發病率隨年齡增加而不斷增高。AD 顯著增加了家庭的負擔，且發病率逐年增加，已成為一個全球的健康問題[4-6]。AD 典型的病理特征主要表現為細胞外淀粉樣蛋白沉積形成老年斑、細胞內Tau 蛋白高度磷酸化形成神經元纖維纏結以及神經元大量凋亡。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的生成和聚集在AD的發病中起核心作用。Aβ 被認為在神經干細胞（NSC）中具有強大的神經毒性。NSC 是自我更新的多能細胞，遷移到最終的位置和功能，成為神經元或膠質細胞。然后，基于NSC 治療的臨床發展仍處于起步階段。姜黃素是一種多酚類化合物，提取自中藥姜黃，可用作香料、食用色素和傳統草藥，具有抗氧化、抗炎、抗癌、改善腦功能、控制肥胖和糖尿病等保健作用[7-8]。相關研究結果表明，姜黃素具有多效性，調節轉錄因子（如NF-kB）、細胞因子（如 IL6， TNF-α）、粘附分子（如ICAM-1）和酶（如 MMPs），在炎癥和惡性腫瘤中起主要作用[9-11]。姜黃素對Aβ 誘導的NSC 損傷是否具有保護作用尚待研究。本研究旨在探討姜黃素對Aβ 誘導的NSC 損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 NSC的提取與分組

選取孕14.5d 的 C57/BL6 小鼠，購買于昆明醫科大學實驗動物中心，合格證號SCXK（滇）-2011004。取胎鼠前腦的側腦室顆粒下層，剪碎，消化為單個細胞，將細胞重懸于12 孔板。體外培養5 ～7d，取5 ～7 代NSC 用 于 實 驗。將NSC 隨機分為對照組、姜黃素組、Aβ 組和觀察組，分別加入DMSO（10 μL）、5 μmol/L 姜黃素10 μL、0.5 μmol/L Aβ 溶液（10μL）及DMSO（10μL）、5 μmol/L 姜黃素和0.5μmol/L Aβ 溶液 10 μL。

1.2 噻唑藍（MTT）測定細胞活力

NSC 置于96 孔板，每孔加入0.2mL NSC 貼壁培養基并給予處理，體外培養48h，采用MTT 法檢測細胞活性，使用酶標儀（美國Molecular Devices 公司，型號FlexStation 3）450nm 測定吸光度。細胞活力=（吸光度/溶劑空白對照組吸光度）× 100%。

1.3 RT-PCR測定

RT-PCR 測定NSC 中巢蛋白（Nestin） mRNA 及凋亡相關基因Caspase3 mRNA 表達。Trizol 試劑提取總RNA，按照 mRNA 試劑盒操作說明合成。RNA 純度和濃度用紫外分光光度法測定。Caspase-3 引物上游序列：5’-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3’，下游序列5’-GCATACTGTTTCAGCAGTTCA-3’，270bp。Nestin 上游 序 列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下 游 序 列5’-TYGGCTCCACCCTTCAAGTG-3’。內 對 照 基 因β 肌 動 蛋 白（β-actin） 引物：5’-GTGGGGCGCCCCAGGC A C C A-3’，5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，682 bp。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。每組重復3 次。

1.4 免疫組化染色

采用免疫組化染色檢測神經細胞標記分子Tuj-1 和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。PBS液漂洗貼壁細胞后使用4%多聚甲醛固定細胞20min，0.3%的Triton-100 打孔15min，封固洗膜，用增強化學發光試劑盒顯色、顯影、定影。曝光后保存圖片，采用Image J 軟件計算陽性細胞數目。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 姜黃素對NSC活力的影響

與對照組比較，姜黃素組NSC 的細胞活力、Nestin mRNA 表 達 明 顯 增 加，Caspase3 mRNA 表 達明顯降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 組和觀察組NSC 活力、Nestin mRNA 表達明顯降低，Caspase3 mRNA 表達明顯增加，差異有統計學意義（P ＜0.05或P ＜0.01）。與Aβ 組比較，觀察組NSCs 細胞活力、Nestin mRNA 表達增加，Caspase3 mRNA 表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

表1 姜黃素對NSC增殖及凋亡的影響（n=5）

2.2 姜黃素對NSC分化的影響

與對照組比較，Aβ 組Tuj-1、GFAP 比例明顯減少（P ＜0.01）；姜黃素組Tuj-1 明顯升高，GFAP 明顯降低（P ＜0.05）；與Aβ 組比較，觀察組Tuj-1、GFAP 明顯增加（P ＜0.01），但明顯低于對照組（P ＜0.05），見表2。

表2 各組Tuj-1和GFAP表達水平的比較（%）

3 討論

AD 是一種具有破壞性的神經退行性疾病，治療方法有限，Aβ 是AD 的一個標志，它在NSC 中具有強大的神經毒性[12]。NSC 是一類具有分裂潛能和自我更新能力的前體細胞，盡管NSC 領域的工作已超過20 年，但該領域仍處于起步階段，因為目前對神經系統疾病中可用于改善中樞神經系統再生的基本機制的了解仍在不斷增長，通過促進神經新生來治療AD 已經成為了NSC 研究的主要方向之一，為神經系統退行性疾病的治療開辟了新的方向。

近年來的研究表明，小膠質細胞分泌的分子在NSC 的細胞命運決定中起著重要作用[13]。Tuj-1 和GFAP 為神經細胞標記分子。GFAP 是中樞神經系統星形膠質細胞、周圍神經系統非髓鞘雪旺細胞和腸內膠質細胞中唯一發現的中間絲Ⅲ蛋白。GFAP基因激活和蛋白誘導似乎在中樞神經系統損傷和神經退行性變后的星形膠質細胞激活（星形膠質細胞病）中起著關鍵作用。GFAP 及其分解產物迅速釋放到生物流體中，使其成為此類神經疾病的有力候選生物標記物。

姜黃素是姜科姜黃屬植物根莖的提取物，近年來，有研究結果究顯示，姜黃素具有明顯的神經保護作用，并且姜黃素可刺激胚胎神經前體細胞增殖，也可增強成年海馬的神經發生[14-16]。姜黃素是一種天然小分子多酚類化合物，是姜黃中一種著名的二芳基庚烷類化合物，姜黃素有抗腫瘤活性[17]，能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導多種腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲轉移和血管生成，抑制某些酶活性，調節腫瘤細胞的信號傳導等[18]。姜黃素的抗癌作用主要是由于腫瘤細胞凋亡通路的激活，以及抑制腫瘤微環境如炎癥、血管生成和腫瘤轉移等所引起的[19-26]。盧曉云等[27]研究發現姜黃素對AOM/DSS 致腸癌有一定的抑制作用，能通過調控Wnt/β-連環素信號通路阻斷EMT 過程，起到防治結腸炎相關結直腸癌的作用。李新等[28]研究認為下調KLF8 基因表達和姜黃素均能通過抑制JAK2/STAT3 信號通路降低乳腺癌細胞活力，誘導細胞凋亡，兩者聯合對細胞活力及凋亡的影響作用更強。唐鄧等[29]研究認為姜黃素在較低濃度時可促進胃正常上皮GES-1 細胞遷移及侵襲能力，姜黃素在高濃度（80μmol/L）時可抑制細胞遷移及侵襲能力，對胃正常上皮細胞及不同分化程度胃腺癌細胞的增殖抑制、誘導凋亡及遷移侵襲能力均呈劑量及時間依賴性。楊秦梅等[30]研究認為姜黃素抑制肺癌干細胞的增殖，誘導其凋亡與Notch 信號通路有關。

本研究通過測定nestin 的表達來鑒定NSC，并通過免疫熒光雙重標記Tuj-1 和 GFAP 來評價NSC的分化，結果顯示， 與對照組比較，姜黃素組NSC的細胞活力、Nestin mRNA 表達明顯增加，Caspase3 mRNA 表 達 明 顯 降 低（P ＜0.05 或P ＜0.01），而Aβ 組和觀察組NSC 活力、Nestin mRNA 表達明顯降低，Caspase3 mRNA 表達明顯增加，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與Aβ 組比較，觀察組NSCs 細胞活力、Nestin mRNA 表達增加，Caspase3 mRNA 表達明顯降低，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），提示姜黃素能增加NSC增殖速度，增加NSC 活力，促進NSCNestin 蛋白mRNA 表達，降低凋亡蛋白Caspase3 mRNA 表達，逆轉AB 對NSC 的損傷，姜黃素的神經保護作用，可能是通過降低凋亡蛋白表達來發揮保護NSC、促進NSC 增殖的作用。與對照組比較，Aβ 組Tuj-1、GFAP 比例明顯減少（P ＜0.01）；姜黃素組Tuj-1明顯升高，GFAP 明顯降低（P ＜0.05）；與Aβ 組比較，觀察組Tuj-1、GFAP 明顯增加（P ＜0.01），但明顯低于對照組（P ＜0.05），提示Aβ 組NSC向神經元、星形膠質細胞分化比例均減少，姜黃素組NSC 向神經元分化，減少星形膠質細胞分化比例；觀察組神經元分化Aβ 組增加，但低于對照組。

綜述所述，姜黃素可促進NSC 增殖，促進NSC向神經元分化，逆轉Aβ 對NSC 的損傷可能是由于抑制了凋亡基因表達，為功能性神經元治療Aβ 沉積所致神經損傷性疾病提供理論依據。