miR-20a-5p在肺結核外周血單核細胞中的表達及臨床價值①

李觀強 張娟娟 梁 娟 林士軍 劉 智 李國保 曾常春 張國良

(深圳市龍崗區人民醫院檢驗科,深圳518172)

肺結核(Pulmonary tuberculosis,PTB)，屬于慢性傳染病，病因為感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)，是傳染病中引起人類死亡的首要原因，在全球范圍內，2017年新增了1 000多萬新發病例和160多萬死亡病例[1]，嚴重危害全球人類健康。因此，找出與肺結核相關基因，快速確診肺結核，對結核病的治療有重要意義。

單核細胞在固有免疫和適應性免疫應答中發揮重要作用，在宿主Mtb感染防御中屬于第一道防線[2]，單核細胞被激活后，可通過自噬、凋亡等多種機制將細胞內的Mtb有效清除[3,4]。

miRNAs是存在于真核生物中的內源性非編碼RNA，長度約20～25個核苷酸，能對基因表達進行調節，進而對細胞的分化、增殖、凋亡及免疫應答等多環節產生影響[5]。有學者的相關研究顯示在肺結核(PTB)、結核潛伏感染(Latent tuberculosis infection,LTBI)、健康捐獻者(Healthy donor,HD)中miRNAs表達譜存在差異[6-9]。miR-17～92簇是一個典型的miRNA家族成員。在人類基因組中，miR-17～92簇編碼6個miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-110。其中，針對miR-20a在腫瘤發生發展過程中發揮的作用的相關研究較多，有報道指出，在甲狀腺未分化癌中，其表達較高，并能促進胃癌細胞增殖，抑制細胞凋亡[10，11]。然而，在Mtb感染過程中，miR-20a是否發揮類似作用以及通過何種機制發揮作用仍然未知。因此，本研究重點探討在結核菌感染過程中單核細胞miR-20a的表達變化情況及其與肺結核診斷、治療的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 PTB人群來自深圳市第三人民醫院，LTBI、HD人群則為到龍崗區人民醫院呼吸科就診者及自行體檢者。PTB診斷標準：以《臨床診療指南·結核病分冊》(中華醫學會，2005年)中的相關診斷要求為參考，符合肺結核的臨床癥狀、體征，肺部陰影，痰涂片及結核菌特異性IFN-γ Elispot檢測均為陽性，排除HBV、HCV、HIV、糖尿病等患者。LTBI人群：未見結核臨床表現， IFN-γ Elispot檢測陽性，無其他合并癥。HD人群的PPD實驗和IFN-γ Elispot均為陰性。經統計分析，最后入組PTB、LTBI、HD各5例。三組年齡、性別分布等基線資料接近，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究符合醫學倫理，經兩院倫理委員會審核并獲得批準，對象知情同意，本人簽署有關證明文書。

1.2方法

1.2.1分選外周血CD14+單核細胞 采集5 ml研究對象外周血，使用肝素鋰抗凝，分離PBMC(應用密度梯度離心法)，取PBMC(1×107個)以及5 μl CD14+免疫磁珠，均為德國Miltenyi公司生產，放入冰箱，4℃環境下孵育20 min后，應用MACS自動磁珠分選儀，將CD14+單核細胞分選出來。

1.2.2提取和測定總RNA 使用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒，具體操作嚴格按照產品說明書進行，從每份樣本中選取1×106個CD14+單核細胞以提取總RNA。使用美國Agilent公司生產的超微量分光光度計測定總RNA的濃度和質量，置入冰箱，在-80℃環境中長期保存。

1.2.3miRNA表達譜的基因芯片檢測 miRNA芯片檢測由深圳華大基因公司完成。按照丹麥Exiqon公司的miRCURY TM Hy3TM Power標記試劑盒說明書進行檢測。先行miRNA的熒光標記，再與miRCURYTM LNA芯片(v.18.0)雜交。隨后使用美國Axon公司的Axon GenePix 4000B芯片掃描儀對芯片的熒光強度進行掃描，使用聚類分析儀(Cluster 3.0)和樹狀視圖分析法來分析數據。

1.2.4TaqMan qPCR驗證miRNA的差異表達 根據miRNA芯片結果，在大樣本人群中分別選取HD、LTBI、PTB各10例對具有明顯差異表達的miRNA分子進行qPCR驗證。RNA的反轉錄采用TaqManTMmiRNA cDNA 試劑盒完成，然后行qPCR擴增。具體反應體系： 10.0 μl TaqManTMmaster mix,1.0 μl miRNA引物，1.5 μl cDNA，7.5 μl RNase free H2O。反應條件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40個循環。以RNU6B作為內參，用2-ΔΔCt表示miRNA的相對表達量。

1.2.5TaqMan qPCR檢測活動性肺結核患者抗結核藥物治療前后miRNA的差異表達 選取5例活動性肺結核患者，在抗結核藥物治療前及治療3個月、6個月后分別采集患者外周血，采用密度梯度離心法分離PBMC，使用免疫磁珠從PBMC中分選出CD14+單核細胞，最后采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒提取CD14+單核細胞的總RNA進行TaqMan qPCR測定，分析miRNA的表達情況。

1.2.6體外驗證實驗 用H37Rv、H37Ra及BCG以MOI=10時分別感染分化的人單核細胞，37℃孵育，分別收集0、15、30、60、90、120、240、480 min時間點的細胞，裂解細胞，采用QIAGEN miR-Neasy Mini Kit 試劑盒提取細胞總RNA，miR-20a-5p的表達量通過qPCR進行檢測。

2 結果

2.1三組CD14+單核細胞miRNA的表達譜對比 三組對象中各選5例，收集外周血分離PBMC，隨后從PBMC中采用磁珠分選出CD14+單核細胞，再提取總RNA，進行miRNA的熒光標記后，將其與miRCURYTM LNA芯片的雜交,最后使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀對芯片的熒光強度進行掃描，使用Significance Analysis of Microarrys 軟件進行聚類分析。結果發現，在三組人群miRNA表達譜中，miR-20a-5p的表達差異最顯著，見圖1。

2.2TaqMan qPCR驗證miR-20a-5p的差異表達 為驗證miRNA芯片結果的可靠性，在大樣本的HD、LTBI、PTB三組人群中各選10例，總RNA樣本采用TaqMan qPCR方法檢測miR-20a-5p的差異表達。結果顯示，miR-20a-5p在三組人群中的表達水平差異有統計學意義，其在活動性肺結核患者中的表達水平顯著低于在HD和LTBI人群中的表達水平(P<0.05,P<0.05)，如圖2所示，該結果與基因芯片的結果一致。

2.3活動性肺結核患者抗結核藥治療后miR-20a-5p分子的表達情況 為了明確miR-20a-5p分子在抗結核藥物治療前后的變化情況，選取5位活動性肺結核患者進行動態隨訪，患者嚴格遵從醫囑，按時服藥，定期檢查。我們分別采集5位患者在用藥前，抗結核藥物治療3個月、6個月后的外周血再次檢測miR-20a-5p的表達。結果顯示，在用藥前，患者體內miR-20a-5p的表達水平相對較低，隨著用藥時間的增加，miR-20a-5p的表達水平增加，如圖3所示，提示在活動性肺結核患者藥物治療后，結核菌被清除或受抑制，而miR-20a-5p表達反而增加。

2.4體外實驗檢測在結核菌感染人單核細胞后miR-20a-5p分子的表達 為了在體外再次驗證miR-20a-5p的表達情況，隨后我們用結核菌強毒株H37Rv、弱毒株H37Ra以及BCG在MOI=10時分別感染分化的人單核細胞，在不同時間點(0～480 min)提取RNA進行檢測。結果顯示，三種菌株感染人單核細胞后，miR-20a-5p分子的表達均顯著下調，以弱菌株下調更為顯著，如圖4所示。

圖2 TaqMan qPCR驗證miR-20a-5p在三組人群中的表達情況Fig.2 miR-20a-5p expression was confirmed by TaqMan qPCR among 3 groups

圖3 藥物治療前后miR-20a-5p分子的表達情況Fig.3 Expression of miR-20a-5p before and after drug treatment

圖4 BCG、H37Ra、H37Rv感染人單核細胞后miR-20a-5p分子的表達情況Fig.4 Expression of miR-20A-5P after BCG,H37Ra and H37Rv infecting human monocytes

3 討論

現階段，臨床抗結核藥物較多，吡嗪酰胺、異煙肼、乙胺丁醇、利福平等，均比較常用，但這些藥物使用后不僅容易產生副作用，嚴重影響其預后的生活質量，而且容易產生耐藥性，嚴重阻礙抗結核的治療。因此，找出副作用少、療效佳的抗結核藥是治療結核病的重要方向。研究證實，miRNA可直接或間接實現對靶基因的調控，參與細胞周期變化及其增殖與凋亡過程，在微生物感染過程中與機體免疫應答、炎癥反應密切相關[12]。有文獻報道，結核患者體內表達各異的miRNA，可視為診斷結核的潛在生物標識[13-15]。

本研究著眼于CD14+單核細胞，將其視為作用靶點，借助miRNA芯片技術，進行相關檢驗和分析，結果證實，HD 、LTBI、 PTB人群中，miR-20a-5p是表達差異最顯著的miRNA，隨即采用TaqMan qPCR技術在大樣本人群中進行驗證，發現miR-20a-5p分子在活動性肺結核患者中表達下調且表達水平顯著低于在HD和LTBI人群中的表達水平。當活動性肺結核患者在抗結核藥物治療后，miR-20a-5p的表達水平逐漸上調。體內實驗表明，結核菌感染后人體單核細胞內miR-20a-5p表達下調，在抗結核治療后miR-20a-5p的下調可逆轉。體外實驗證實用BCG、H37Ra、H37Rv在MOI=10時分別感染分化的人單核細胞，發現三種菌株均明顯抑制miR-20a-5p表達，而以弱毒株下調最為顯著。由于單核細胞在機體免疫應答及結核菌感染過程中有重要作用，因此肺結核患者單核細胞中miR-20a-5p分子的差異表達，可準確反映感染結核菌后，機體出現的免疫應答反應，所以，可將其視為診斷結核的潛在生物標記，且也有可能被視為肺結核靶向治療的新靶點。

不過，本實驗對患者miR-20a-5p分子的下調機制并未展開研究，因而對結核菌對單核細胞內miR-20a-5p分子表達水平的影響機制尚不明晰。其次細胞凋亡是機體控制結核分枝桿菌感染的主要防御機制之一，結核病患者體內miR-20a-5p分子表達降低是否與細胞凋亡有關以及通過何種機制來促進凋亡都是未知的，需進一步驗證miR-20a-5p在肺結核中的診斷價值，這些都是未來的研究方向。