益經湯對卵巢功能減退模型大鼠卵巢Bcl-2、Bax 蛋白的影響※

萬云慧 陶莉莉 陳曉勇

（1 江西省婦幼保健院中醫科，江西 南昌 330006；2 廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，廣東 廣州 510405）

卵巢功能減退 （diminished ovarian reserve，DOR）是指女性患者40 歲以前出現卵巢功能的減退，以月經的異常改變（如月經量增多或月經量減少）、不孕為主要的臨床表現［1］。近年來，DOR 的發病率越來越高，越來越年輕化，如若DOR 患者得不到及時有效的治療，將最終進展為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。目前關于DOR 病因尚不明確，現代醫學認為可能與遺傳、免疫、心理及環境因素等有關［2］。目前西醫主要采取人工周期激素替代療法，人工周期療法雖然可以改善患者一系列的低雌激素癥狀，在一定程度上改善患者的生活質量，但遠期的總體效果并不十分理想。長期使用，不良反應多，如出現肝腎功能的異常，增加子宮內膜癌、乳腺癌、靜脈血栓的風險。近年來，隨著中醫藥的不斷發展，中藥治療DOR 取得不錯的進展。本人以往的研究顯示加減益經湯具有補腎健脾、疏肝活血的作用，能夠改善卵巢的功能，本研究將通過觀察加減益經湯對DOR 模型大鼠卵巢顆粒細胞上Bcl-2 及Bax 蛋白表達的影響，進一步探討加減益經湯改善卵巢功能、治療DOR 的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12 周鼠齡的清潔級成年Spragne-Dawley（SD） 雌性大鼠，體質量約為（230±10） g。由廣東省中醫研究提供，共60 只。

1.2 實驗藥物 加減益經湯：熟地黃20 g，菟絲子20 g，當歸10 g，白芍10 g，丹參15 g，黨參20 g，柴胡6 g 等9 味中藥組成。將以上藥物重復煎煮、過濾2 次，將濾液混合，然后將其濃縮為中藥高劑量含生藥2.36 g/mL，中藥中劑量含生藥1.18 g/mL，中藥低劑量含生藥0.59 g/mL，裝瓶冷卻后，低溫儲藏（由廣東省中醫研究所制備）。戊酸雌二醇片（補佳樂）：拜爾醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：國藥準字J20130009。

1.3 動物分組方法 隨機將大鼠分為空白組、模型組、中藥湯高、中、低劑量組和補佳樂組。

1.4 DOR 大鼠模型的建立 空白組大鼠單次腹腔注射1 mL 0.9% 生理鹽水，剩下的5 組大鼠均單次腹腔注射環磷酰胺 （CTX） 75 mg·kg-1。

1.5 給藥方法 各組大鼠都以相同的標準的飼料來飼養，在腹腔注射2 h 后，當日就開始灌胃，空白組和模型組均灌胃2 mL 的0.9% 生理鹽水；中藥高劑量組：以23.6 g/kg 加減益經湯灌胃；中藥中劑量組：以11.8 g/kg加減益經湯灌胃；中藥低劑量組：以5.9 g/kg 加減益經湯灌胃；補佳樂組：以0.09 mg/kg 補佳樂灌胃，1 d 1 次，連續灌胃共4 周。

1.6 檢測指標4 周灌胃結束后，處死大鼠，完整取出其卵巢組織，經福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，SP 法按試劑盒分別進行免疫組化測定Bax、Bal-2及AMH 蛋白的表達。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行統計，計量資料用均數±標準差（x±s）表示；多組間均數的比較，方差齊時采用單因素方差分析，組間均數兩兩比較，采用LSD-t 檢驗；方差不齊時采用Kruskal Wallis H 法。兩兩比較采用Noparapotric Nemenyi test。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AMH 及Bcl-2的蛋白表達降低，Bax 蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，中藥高、中劑量組Bcl-2蛋白表達及AMH 升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；補佳樂組、中藥高、中、低劑量組Bax 蛋白的表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 加減益經湯對DOR 模型大鼠卵巢組織AMH、Bcl-2 及Bax 的影響 （x±s）

3 討論

加減益經湯是由益經湯加減而成，益經湯出自傅山的《傅青主女科》，其中對月經的生理高度概括為“經水出諸腎”，并明確列出“年未老經水斷”“女子七七而天癸絕，有年未至七七而經水先斷者……誰知是心肝脾之氣郁乎”。傅山所指的“年未老經水斷”應為現代的DOR、POF，并認為其病因病機是心肝脾氣郁，導致腎氣郁而不宣，不能盈滿而溢泄。治療大法為補腎健脾疏肝，創制益經湯，組方中熟地黃、當歸、杜仲補腎養血，黨參、白術、山藥健脾益氣，柴胡、白芍疏肝解郁，酸棗仁、牡丹皮清心，沙參補益肺氣，加減益經湯在此基礎上加菟絲子（增強了補腎的作用），加丹參（“一味丹參，功同四物”），去白術、山藥、生棗仁、丹皮（減少了方劑藥物的組成），改人參為黨參。治療大法與益經湯相似，全方配伍重在補腎健脾、疏肝活血，而兼有清養心肺的功效。臨床上已表明其能改善DOR 患者低雌激素癥狀，改善DOR 患者的卵巢功能［3］。經現代藥理學分析加減益經湯中的絕大多數藥物具有調節內分泌及抗衰老的功效，在治療DOR 上具有多靶點、多環節、多途徑及多系統的治療優勢。

卵巢功能包括卵泡的數量和卵泡的質量，所以DOR高度概括起來就是卵泡數量與質量的下降。目前很多研究表明卵泡的減少與卵巢顆粒細胞（GC） 的凋亡有關，所以DOR 的發病機制之一就是GC 的凋亡，而凋亡與B 細胞淋巴瘤 （Bcl-2）/B 細胞淋巴瘤相關X 蛋白（Bax） 的比值密切相關［4］。Bcl-2 抑制顆粒細胞的凋亡，Bax 促進顆粒細胞的凋亡，而Bax 與Bcl-2 通過形成異源或同源的二聚體，共同調節顆粒細胞的凋亡。當Bax 與Bcl-2 形成異源二聚體時，即Bc1-2 比Bax 的比例大時，則抑制顆粒細胞的凋亡；當Bax 與Bcl-2 形成同源二聚體時，即Bax 與Bc1-2 的比值大時，則促進顆粒細胞凋亡［5-6］。

張永芳等［7］通研究發現CTX 能夠使大鼠的動情周期發生紊亂，升高FSH 及LH 水平，降低AMH 及E2水平，升高卵巢組織Caspase-3 蛋白表達，降低Bcl-2 蛋白表達，卵巢間質組織纖維化，認為CTX 通過使大鼠卵巢顆粒細胞凋亡、卵巢間質損傷及纖維化而導致大鼠的卵巢功能衰竭。王雪峰等［4］認為卵巢早衰的病機是卵泡的過快衰竭，卵泡顆粒細胞的存亡則取決于Bcl-2/Bax 的比值，Bcl-2/Bax 在卵巢功能的變化中發揮著極其關鍵的作用。劉惠芳等［8］通過觀察大鼠腹腔注射CTX 后，大鼠卵巢組織中的原始卵泡的數目明顯減少，從而導致大鼠卵巢功能下降。很多學者［9-11］認為卵母細胞的凋亡及顆粒細胞的凋亡介導了卵泡的閉鎖是造成卵巢儲備功能下降的根本原因。

此實驗結果顯示經CTX 造模后，大鼠卵巢組織上的Bax 表達上升，Bcl-2 蛋白表達及AMH 均下降，提示模型組卵巢顆粒細胞Bcl-2 蛋白表達的降低及Bax 蛋白表達的升高有可能加速卵泡的過早凋亡，從而導致了DOR，并由此推測CTX 引起DOR 的機制之一與卵巢的卵泡的凋亡有關。與模型組比較，中藥高、中劑量組Bcl-2 蛋白表達及AMH 升高，補佳樂組、中藥高、中、低劑量組Bax 蛋白的表達降低，提示補佳樂和加減益經湯能夠通過增加卵巢顆粒細胞上Bcl-2 蛋白的表達，降低Bax 蛋白的表達，從而抑制卵泡的過快、過早地凋亡，以進一步起到治療DOR 的作用。

綜上所述，DOR 的發病機制可能與Bcl-2 蛋白低表達和Bax 高蛋白表達導致卵泡過快、過早的凋亡有關。加減益經湯能夠通過調控Bcl-2/Bax，即下調Bax 蛋白的表達，上調Bcl-2 蛋白的表達，從而抑制卵泡的過早、過快凋亡，可能是加減益經湯改善卵巢的功能，治療DOR 的機制之一。