斯鈣素2在高糖誘導的肝細胞炎癥反應中的作用機制

陶文玉 陳郊麗 李曉進 熊煜欣 洪超 王曉苓

1 云南省第二人民醫院（昆明650021）；2中國醫學科學院和北京協和醫學院醫學生物學研究所（昆明650031）

糖尿病是一種內分泌代謝性疾病，顯著的特點之一是體內胰島素的降低，血糖的升高，影響糖尿病治療最主要的因素是安全有效藥物的缺乏［1］。研究發現，糖尿病與肝癌、結腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等腫瘤的發生存在密切關系。大量的研究表明，糖尿病患者罹患肝癌的風險顯著高于非糖尿病患者，而糖尿病一線治療藥物二甲雙胍和噻唑烷二酮類化合物（胰島素增敏劑）的使用能夠降低肝癌高風險人群罹患肝癌的幾率［2-4］。但在2 型糖尿病的二甲雙胍臨床治療中，部分患者出現諸如腹痛等胃腸道不良反應，其中以乳酸酸中毒最為危險［5-6］。而胰島素作為糖尿病治療的最有效藥物，同樣也存在一定的不足，胰島素可以直接通過影響胰島素樣生長因子受體（IGFs）參與腫瘤的發生［7］。因此尋找新穎的糖尿病治療靶點，并鑒定其分子機理，對于開發新的糖尿病治療藥物具有非常重要的意義，同時對于深入了解并干預糖尿病慢性并發癥，如肝損傷、腎臟損傷等，也具有廣闊的前景。本研究從糖尿病性肝病中的肝臟炎癥入手，通過分析多個糖尿病肝病動物模型發現在糖尿病模型組中肝臟STC2 的表達顯著增加，而炎癥信號通路在糖尿病性肝病的發生發展過程中發揮重要的功能，那么STC2 是否通過調控炎癥信號通路參與糖尿病性肝病的發展？這對于深入分析并開發針對糖尿病性肝臟炎癥的干預方法具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI1640 培養基，青霉素-鏈霉素（10 000 U/mL），脂質體轉染試劑lipofectamine 2000，購自賽默飛世爾科技公司；胎牛血清（FBS）來自于Gibco；MTT（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide）、G418 硫酸鹽和Dglucose 購買于Sigma 公司；RNA 提取試劑盒Trizol、反轉錄試劑盒來源于上海源葉生物技術公司；qPCR SYBR?定量試劑盒購自Takara 公司；引物序列根據NCBI 設計工具Primer-BLAST 設計，并由華大基因合成，經PAGE 純化，引物序列如下，STC2（human）：上游引物5′-TCTTGTGAGATTCGGGGC TT-3′，下游引物5′-ACAGGTCGTGCTTGAGGTAG-3′；IL-6（human）：上游引物5′-ACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′，下游引物5′-CCATCTTTTTCAGCCATCTTT-3′；TNFα（human）：上游引物5′-CCCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，下游引物5′- GATGGCAGAGAGGAGGTTGAC-3′；GAPDH（human）：上游引物5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，下游引物5′-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′；STC2（mouse）：上游引物5′-CTGGGCCAGTTTGTGACCC-3′，下游引物5′-ACGTCATGCAAATCCCATGTAAA-3′。STC2 抗體、β-actin 抗體、辣根過氧化物酶標記的鼠/兔二抗購買自Santa Cruz 公司；磷酸化p65（p-p65）抗體、p65 抗體、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體、STAT3 抗體來源于CST 公司。

1.2 細胞株正常肝細胞株LO2，來源于美國標準生物品收藏中心（ATCC），傳代次數不高于5 次，保存于液氮中。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養和質粒轉染LO2 正常肝細胞培養在添加10% FBS 和100 U/mL 青霉素-鏈霉素試劑的RMPI 1640 培養基中，在細胞培養箱中培養，培養條件為5%CO2，溫度為37 ℃。在LO2 細胞中轉染pcDNA3.1（+）-STC2 質粒采用lipofectamine 2000 脂質體試劑，細胞密度約60%，更換低濃度血清的培養基（reduced serum opti-medium）。轉染操作方法按照說明書所述，轉染6 h 后吸去孔內培養基，更換含10%FBS 的完全培養基繼續培養。

1.3.2 構建穩定過表達STC2 的肝細胞株STC2全長cDNA 序列克隆到含有新霉素抗性基因的pcDNA3.1（+）載體中，使用lipofectamine 2000 脂質體試劑轉染到LO2 細胞中，轉染培養48 h 后，加入100 μg/mL 的G418 篩選濃度篩選陽性細胞，挑取3個單克隆細胞并進行擴大培養。qRT-PCR 和Western Blot 分析細胞中STC2 表達水平，進行鑒定。鑒定成功后，后續培養繼續維持25 μg/mL 的G418，防止抗性丟失。

1.3.3 實時熒光定量PCR 檢測細胞經過RNA提取試劑Trizol 裂解5 min，加入氯仿，充分混勻，室溫靜置分離。高速離心后，吸取上層溶液，經異丙醇沉淀后，再用75%的乙醇溶液洗滌兩次，加入DEPC 水溶解，得到總RNA。得到的總RNA 經過基因組DNA 去除劑處理，按照反轉錄試劑說明書進行反應。獲得的cDNA 產物測定濃度后，調整到100 ng/mL，用于熒光定量PCR 檢測。實時熒光定量PCR 采用SYBR?Green 試劑盒，反應體系配制比例參照說明書。熒光定量PCR 數據的顯示采用Ct 值，數據的分析采用2-ΔΔCt法。

1.3.4 Western Blot 檢測在不同時間梯度下，高糖處理LO2 細胞，冰PBS 溶液輕輕洗滌細胞一次，刮取細胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解細胞20 min，15 000 g 離心10 min，吸取上清溶液到新的離心管中。加入loading buffer 后99 ℃處理10 min，立即置于冰上，即可進行SDS-PAGE 凝膠電泳電轉。采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，經過TBST 溶液洗滌3 次后，4 ℃孵育一抗過夜。再次TBST 溶液搖床上洗滌3 次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST 溶液充分洗滌3 次后，每次10 min，進行ECL 化學發光檢測。蛋白表達水平的相對定量使用Image J 軟件進行灰度密度值分析。

1.3.5 MTT 法檢測細胞增殖調整細胞懸浮液的細胞密度至5×104cells/mL，于96 孔細胞培養板中加入100 μL 細胞懸浮液。培養過夜后，加入Dglucose 30 mmol/L，繼續培養24 h 后，加入MTT 溶液，每孔加入50 μg 的MTT，繼續培養3 h，小心移去孔內培養基。每孔中加入100 μL 的DMSO 溶液，室溫振蕩5 min，充分溶解紫色結晶后，于酶標儀490 nm 波長下測定吸光值。

1.3.6 差異基因GEO篩選高脂飲食喂養C57BL/6 小鼠21 周，誘導糖尿病相關模型，分析肝臟中基因表達變化，GEO 參考號為GSE24031，測序芯片平臺為GPL1261，分析了10 只正常飲食小鼠和8只高脂飲食誘導組，通過GEO 自帶的數據分析工具分析STC2 的相對表達變化。

1.3.7 鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病肝病模型小鼠分析肝臟中STC2 的表達變化，STZ 的溶媒為1%的吐溫80 溶解于生理鹽水中，將含有0.02 mol/L的STZ 的誘導劑以100 mg/kg 的劑量尾靜脈注射C57BL/6 小鼠，小鼠全部選用10 周齡雄鼠，對照組注射相應體積的溶媒溶液，對照組和誘導組小鼠數量均為8 只。誘導72 h 后，開始禁食過夜，測定空腹血糖，超過12 mmol/L 定義為糖尿病小鼠。而臨床治療中發現部分糖尿病患者表現出肝損傷等肝病表征，因此把糖尿病并發的肝損傷也稱之為糖尿病肝病，本研究通過檢測小鼠天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）等肝臟生化功能指標，確定糖尿病肝病模型的成功構建［8］。處死小鼠，解剖取肝臟，經過冰冷PBS 溶液清洗后，加入液氮進行研磨，加入RNA 提取試劑，進行熒光定量PCR 操作。對比正常組小鼠，分析糖尿病誘導模型組小鼠肝臟中STC2 的表達水平變化。

1.4 統計學方法本文數據的處理均采用Graph-Pad Prism7 軟件進行作圖和統計分析，實驗數據的表示以均數±標準差的方式。兩組間比較采用Student′s t 檢驗，P ＜0.05 表示差異具有統計學差異。

2 結果

2.1 在糖尿病性肝病模型小鼠中STC2 的表達顯著增加通過分析高脂飲食（HFD）誘導的糖尿病模型小鼠中的肝組織基因水平變化，發現與正常飲食組（NFD）小鼠STC2 基因在糖尿病性肝病模型小鼠肝臟中顯著增加約10%（圖1A）。為了進一步證實在糖尿病性肝病發病過程中STC2 基因的表達變化，通過STZ 尾靜脈注射誘導糖尿病肝病模型小鼠，通過分析小鼠肝臟生化指標ALT、AST 確認糖尿病肝病模型的成功建立（圖1C-D）。同時通過qRT-PCR 分析肝臟中STC2 的表達，同樣發現在糖尿病肝病模型小鼠肝臟中STC2 的表達水平顯著增加（P ＜0.01，圖1B）。

圖1 在高脂飲食和STZ 誘導糖尿病小鼠肝臟中STC2 表達顯著增加Fig.1 The expression of STC2 in the liver was elevated in HFD and STZ-induced diabetic disease model

2.2 高糖誘導肝細胞中STC2 表達，并促進炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達通過體外高糖誘導處理正常肝細胞LO2，發現高糖能夠誘導STC2 蛋白表達增加，并且呈時間依賴性的關系（圖2AB），熒光定量PCR 結果也發現高糖能夠促進STC2 的mRNA 表達上調（圖2C）。同時分析了高糖誘導下，炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達變化，發現高糖在誘導STC2 表達的同時，也大量誘導促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達。這一結果說明，在高糖的刺激下，肝細胞存在炎性響應反應，并且STC2 的蛋白和mRNA 表達也被大量誘導表達。

圖2 高糖誘導肝細胞STC2 表達上調，并促進促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達Fig.2 High glucose could induce upregulation of STC2 and enhanced the expression of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-6

2.3 在高糖條件下，STC2 的表達與促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達存在正相關的關系通過皮爾森系數（Pearson ratio）分析STC2 與TNFα 的表達相關性，發現在高糖刺激下，STC2 的表達與IL-6 的相關系數為0.748 8，95%置信區間為0.168 5 至0.943 7，由此可見，STC2 與IL-6 的表達存在較強的相關性（圖3A）。而STC2 與TNFα 的相關系數為0.968 4，95%置信區間為0.852 6 至0.993 5，這說明STC2 與TNFα 的表達存在非常強的表達相關性（圖3B）。

圖3 在高糖刺激下，肝細胞中STC2 的表達與IL-6 和TNF-α 存在正相關的關系Fig.3 Under the condition of high glucose，the expression of STC2 was positively correlated with IL-6 and TNF-α expression in the liver cells

2.4 成功構建穩定過表達STC2 的肝細胞株在正常LO2 肝細胞中構建穩定過表達STC2 的細胞株，通過G418 篩選，選取3 個細胞繼續擴大培養，進行Western Blot 檢測蛋白表達水平，并通過qRTPCR 檢測細胞中mRNA 的表達水平，從圖4 中可以看出過表達的三株細胞在蛋白水平和mRNA 水平都顯著高于對照組細胞，成功構建穩定過表達STC2 的正常肝細胞。

2.5 高糖刺激下，STC2 促進炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達通過過表達STC2 發現，在過表達STC2的LO2肝細胞中，高糖誘導的促炎性因子IL-6和TNF-α表達水平進一步提高，并且在沒有高糖刺激下，在肝細胞中過表達STC2 也能夠一定程度上增強促炎性因子IL-6和TNF-α的表達（圖5）。

2.6 在肝細胞中過表達STC2，促進STAT3 和NFκB 通路的激活通過在LO2 肝細胞中過表達STC2，發現過表達STC2 能夠顯著激活NF-κB 和STAT3 信號通路（圖6），這些證據表明STC2 能夠通過激活NF-κB 和STAT3 信號通路，促進促炎性因子IL-6 和TNF-α的表達。

圖4 構建穩定過表達STC2 的LO2 肝細胞Fig.4 The construction of stable overexpressing STC2 in LO2 liver cells

圖5 在肝細胞中過表達STC2，能夠促進高糖誘導的TNF-α 和IL-6 表達Fig.5 Overexpression of STC2 enhanced high glucoseinduced the expression of TNF-α and IL-6 in LO2

圖6 在LO2細胞中過表達STC2，激活STAT3和NF-κB通路Fig.6 Overexpression of STC2 could activate the STAT3 and NF-κB pathway

2.7 高糖抑制正常肝細胞增殖，過表達STC2 進一步增強高糖的抑制增殖作用通過MTT 實驗發現，高糖刺激下，肝細胞的增殖能力顯著下降，而過表達STC2 能夠進一步增強高糖所誘導的肝細胞增殖抑制能力。同樣值得注意的是，在無高糖應激的情況下，過表達STC2 也能夠抑制肝細胞LO2 的增殖（圖7）。

圖7 高糖抑制肝細胞增殖，過表達STC2 能夠增強高糖抑制增殖作用Fig.7 High glucose inhibit the proliferation of liver cells，and overexpression of STC2 could enhance the inhibition of proliferation

3 討論

糖尿病性肝病是糖尿病的一種并發癥，糖尿病與肝病之間存在密切的聯系［10-11］。非酒精性脂肪肝就是糖尿病性肝病最顯著的病變［12］。而目前針對糖尿病的治療藥物種類很少，也存在多種副作用。因此開發新的糖尿病治療靶點，特別是針對糖尿病性肝病、糖尿病性腎病等并發癥，具有非常顯著的研究意義。

本研究主要針對糖尿病性肝病，篩選發現STC2 基因在STZ 誘導的糖尿病性肝病小鼠模型中表達水平顯著上升，說明STC2 基因可能參與糖尿病性肝病的發生過程，有可能在糖尿病的病理過程中發揮調控作用。為進一步研究STC2 在糖尿病性肝病過程中潛在的分子功能，通過體外高糖刺激正常肝細胞LO2，發現高糖條件下，能夠呈時間依賴性的方式誘導STC2 的表達，而且高糖條件下，促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達也顯著增加，并且通過進一步的分析發現STC2 與TNFα 和IL-6存在較強的正相關關系，這些證據表明STC2 在高糖誘導的肝細胞炎性反應過程中存在某種調控關系。鑒于STC2 在高糖刺激的肝細胞炎性響應過程中的作用，為進一步深入研究STC2 在糖尿病性肝病中的功能，通過過表達STC2，發現在正常肝細胞LO2 中過表達STC2 能夠促進高糖誘導的促炎性反應過程，而且在沒有高糖的應激條件下，STC2 還能夠直接影響TNF-α 和IL-6 促炎性因子的表達。說明在高糖誘導的肝細胞促炎性過程中，高糖能夠引起肝細胞中TNF-α 和IL-6 的表達增加，而且高糖能夠促進STC2 的表達，而STC2 又能夠直接通過影響促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達，形成這樣的促進網絡，進一步說明STC2 在高糖刺激的肝細胞炎癥反應過程中具有顯著的作用。

本研究通過分析炎癥信號通路，發現STC2 能夠激活STAT3 和NF-κB，而TNF-α 和IL-6 是STAT3和NF-κB 信號通路的重要的靶基因［13-15］，本研究表明STC2 能夠通過激活NF-κB 和STAT3 信號通路，促進促炎性因子IL-6 和TNF-α 的表達，而介導高糖誘導的肝細胞炎癥反應過程。目前的研究發現在高糖等代謝應激條件下，炎癥免疫信號分子發揮重要的功能，這與本研究的結果是一致的，同時本研究也發現STC2 作為一個新穎的分子，不僅參與高糖應激過程，還參與炎癥信號網絡，因此STC2 在代謝應激和炎癥免疫交互調節網路中扮演重要的角色。高糖刺激的促炎性反應過程，往往伴隨肝損傷［16］，為進一步深入研究STC2 在高糖促炎性應激過程中對肝細胞的功能，本研究通過肝細胞增殖功能實驗，發現高糖誘導的STC2 能夠促進高糖應激所引起的肝細胞增殖抑制功能，這進一步說明STC2 不僅參與高糖所誘導的肝細胞炎癥反應過程，而且還參與肝細胞的增殖功能調節中。本研究顯示STC2 在糖尿病肝病模型小鼠肝臟損傷中以及高糖誘導肝細胞炎癥反應過程中都發揮重要的促進作用，因此針對STC2 的抑制劑的開發，也具有廣闊的研究前景。綜上所述，本研究首次發現STC2 是一個潛在治療糖尿病性肝病的新穎靶標，在肝細胞中，STC2 能夠通過激活STAT3 和NF-κB 通路促進促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達，并且STC2 還參與肝細胞的增殖生理功能中，為深入了解糖尿病性肝病的發病機理和研究干預策略提供了新的思路。