生物硝化抑制劑的抑制原理及其研究進展

張洋 李雅穎 鄭寧國

摘要：為維持和提高農作物產量，大量氮肥施入農田生態系統中。所施入的氮肥通過硝化過程形成硝態氮，其易淋溶或通過反硝化作用損失，造成大量氮素流失，影響農業生產的可持續性且帶來生態環境問題。硝化抑制劑可抑制硝化作用，而植物根系分泌的生物硝化抑制劑以其成本低、環境友好等優點逐漸引起關注。本文綜述了國內外植物源硝化抑制劑的研究進展，包括分泌生物硝化抑制劑的植物種類、生物硝化抑制劑的作用機制及影響因素;總結了生物硝化抑制劑對農業的影響及對生態環境的保護作用，并從農業生產和環境保護的角度出發，對今后生物硝化抑制劑的研究方向進行了展望。

關鍵詞：生物硝化抑制劑;農業系統;生態環境;氮循環

中圖分類號： S143.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0021-06

為了滿足全球不斷增長的糧食需求，人類在農業系統中施入大量氮肥。在促進糧食生產的同時，也造成了嚴重的環境污染，如水體富營養化、地下水硝酸鹽污染、氧化亞氮（N2O）和一氧化氮（NO）等溫室氣體的排放[1]。在農業生產工業化以前，氮的收支長期處于相對平衡的狀態，即固氮作用和脫氨作用基本持平。但自20世紀30年代以來，地球氮循環一直被打亂[2]，尤其是1960—2009年間的綠色革命，大量使用工業復合肥來栽培水稻和玉米，雖然生產了全球近1/4的糧食，但卻嚴重地破壞了生態環境[3-4]。全球每年氮肥的消耗量將近1.5×108 t，而強硝化作用導致了近70%的氮肥流失[5]，每年直接造成的經濟損失約8 100萬美元（尿素的價格是0.54～0.80美元/kg）[6]。預計到2050年全球氮肥的施用量會翻1倍達到每年3.0×108 t[6]，每年從農業系統中流失的硝態氮所造成的氮損失將會達到6.15×107 t[7]，這會增大農業系統中氮肥的流失風險，加劇環境污染問題。

礦化（mineralization）、硝化（nitrification）和反硝化（denitrification）是土壤氮循環的重要過程[8]。氮素的礦化作用是土壤有機氮在微生物作用下分解成無機氮的過程;而硝化作用是銨態氮（NH+4-N）在有氧條件下，微生物的作用下經氨氧化和亞硝酸鹽氧化2步反應轉化為硝酸鹽的過程[9];Pjevac等于2015年從硝化螺旋菌屬（Nitrospira）中發現并培養了1株完全硝化細菌，這種化能自養型微生物的基因型可以編碼氨氧化和亞硝酸鹽氧化2個途徑中的蛋白，完全硝化菌是氮循環中微生物群落的一個重要成分，它的發現改變了人們對硝化過程的認識[10]。反硝化作用也稱脫氮作用，是反硝化細菌在無氧條件下，還原硝酸鹽，釋放出氮氣（N2）或N2O的過程。現代農業所用氮肥以銨態氮肥料（尿素、硫酸銨）為主，銨態氮經過硝化作用形成硝態氮，硝態氮帶有負電荷，不能被土壤吸收，具有很高的流動性，在根區容易受淋溶和反硝化作用的影響[11]。因此，硝化作用是氮素從土壤生態系統中流失的主要原因，且硝態氮的淋失造成了地下水和地表水污染[12]。此外，農田系統是N2O的主要排放源，硝態氮通過反硝化過程產生N2O，且植物對硝態氮的同化作用會直接增加植物樹冠對N2O的排放。氧化亞氮是造成全球變暖的三大溫室氣體之一，排放量一直在增加。雖然N2O在大氣中含量比較低，但其增溫潛勢卻是二氧化碳（CO2）的298倍[13]。研究表明，2014年大氣平均N2O的摩爾分數是18世紀50年代的121%[14]。因此，提出切實可行的農業減排措施對控制全球氣候變暖有重要意義[9]。

抑制硝化作用和減少土壤氮肥的投入是提高農業系統中氮肥利用和減少N2O排放的關鍵方法[15]。用化學抑制劑來控制硝化作用已經被證實可以有效地提高氮肥利用率和降低環境污染[16]，與此同時，研究人員發現一些植物根際分泌的化合物對土壤硝化過程也存在抑制作用，這些化合物被稱為生物硝化抑制劑（biological nitrification inhibitor，簡稱BNI）。BNI指在自然生態系統中，特定植物根系產生的、可以通過抑制氨氧化微生物活性從而起到抑制硝化作用的化合物[17]。本文綜述目前國內外已知的、具有生物硝化抑制功能的植物及其作用機制，總結生物硝化抑制劑在農業生產和生態環境保護方面的作用，并從農業和環境的角度出發，對今后生物硝化抑制劑的研究方向進行展望，為調控氮素循環、提高氮素利用率和減少土壤溫室氣體排放提供科學參考。

1 化學合成硝化抑制劑

硝化抑制劑（nitrification inhibitor，簡稱NI）是一類能夠抑制土壤硝化微生物活性物質的總稱，可以有效減緩土壤中NH4+向NO2-、NO3-的轉化，如2-氯-6-三氯甲基吡啶（nitrapyrin）、雙氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）、4-氨基三唑（AM/AT/ATC）、硫脲（TU）等[16]。其技術原理：硝化抑制劑抑制了土壤中的亞硝化、硝化甚至反硝化過程，從而阻礙了NH4+向NO2-、NO3-的轉化過程。硝化抑制劑與氮肥配合施用，通過抑制硝化細菌的活性，抑制亞硝化、硝化、反硝化作用，使施入的銨態氮能夠較長時間以NH4+-N的形態存在并供作物利用，從而提高肥效，并減少硝態氮和亞硝態氮的淋溶和反硝化的氮素損失。不同類型的硝化抑制劑有不同的作用機制，例如DCD、DMPP等通過產生毒性來抑制氨氧化細菌的活性，進而抑制NH3氧化成NO2-;氰酸鹽（cyanate）和氯酸鹽（chlorate）等可抑制硝化桿菌屬細菌的活性，從而抑制NO2-氧化成NO3-[15，17-18]。

將硝化抑制劑與肥料同時施入土壤，可以降低氮肥的淋失和反硝化作用的損失，不僅提髙了對氮肥的利用率，還減少了對環境的污染[11]。化學合成的硝化抑制劑DCD、DMPP經過了大田試驗的評估，被人們廣泛應用[18]。硝化抑制劑在無機氮含量高、氮淋失嚴重和反硝化較強的土壤中效果明顯。但硝化抑制劑存在成本較高、應用不方便且容易造成環境污染等缺點，特別是一些可溶于水的抑制劑會造成地表水和地下水污染[12]。以DCD為例，使用高濃度DCD（DCD用量為氮肥施用量的10%）才能達到所期望的抑制效果，但DCD可溶于水，易從植物根區流失造成環境污染[19-20]。相對于這些化學合成的硝化抑制劑的種種限制，生物硝化抑制劑不僅不會污染土壤，而且易于從自然界中得到，成本低廉，抑制時間較長，效益較高[21]。

2 生物硝化抑制劑

1966年，Munro等發現，森林與草地土壤存在硝化作用減緩的現象[19]，隨后生物硝化抑制劑的概念第1次被提出[22]，即BNI源于自然環境，易被微生物降解利用，是1種環境友好型的硝化抑制劑[23]。盡管20世紀60年代就已經開始了對BNI的研究，但由于缺乏準確檢測BNI活性的方法，使得對土壤系統中BNI功能的驗證受到了阻礙。直到2006年，Subbarao等改進了生物化學發光法（其原理為待測物濃度與體系內的生物發光強度在一定條件下呈線性關系），研究者重組了亞硝化單細胞菌（Nitrosomonas europaea），使其攜帶1個具有哈氏弧菌（Vibrio harveyi） lux AB基因表達載體，分析時在30 s內產生清晰的雙峰值發光模式[25]，亞硝化單細胞菌的生物熒光發射強度和亞硝酸鹽的產量呈線性關系。以化學抑制劑烯丙基硫脲（allylthiourea，簡稱AT）作為對照，將濃度為0.22 μmol/L的AT對亞硝化單細胞菌產生的抑制效果定義為1個ATU（烯丙基硫脲）單元。根據AT的濃度梯度與生物發光強度所得到的線性方程對待測物濃度進行定性和定量分析，樣品（根際土提取物、植物等）的抑制效果可用ATU單元來表達和對比[24-25]。生物熒光分析的發展使準確量化植物根系分泌BNI的能力成為可能。

研究顯示，非洲濕生臂形牧草（Brachiaria humidicola）和俯仰臂形草（Brachiaria decumbens）有較強的分泌硝化抑制劑的能力[17]，在長期缺乏氮素的南美洲熱帶稀樹草原上，這些牧草根系能夠通過分泌抑制硝化活性的物質來減少土壤銨態氮轉化為硝態氮的量，避免氮素以硝態氮的形式淋失。研究表明，楊梅樹（Arbutus unedo）對土壤硝化活性也具有抑制作用[26-27]。關于禾本科植物的研究已經證實玉米根系沒有分泌生物硝化抑制劑的能力，但高粱、小麥和水稻的根系具有釋放硝化抑制劑的能力[17]。

2.1 生物硝化抑制劑的作用原理

自養型氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）是硝化作用的主要功能微生菌群，在低氮環境里，由于AOA對底物NH3的親和力更高，因此比AOB的適應性好[24]。氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，簡稱AMO）和羥胺氧化還原酶（ hydroxylamine oxidoreductase，簡稱HAO）是AOB和AOA進行氨氧化過程的關鍵酶。AOB的AMO三聚體膜結合蛋白由amoA、amoB和amoC 3個亞基組成，其中含有酶活性位點的是amoA亞基，可催化氨（NH3）氧化成羥胺（NH2OH），羥胺再經由HAO作用生成NO2-[27-29];AOA編碼AMO的基因中不會同時包含編碼amoA、amoB和amoC的基因，但一定含有編碼amoA的基因[17]，此外，在AOA中檢測不到編碼HAO的基因，同時AOA也缺少編碼細胞色素C的基因，而細胞色素C對AOB氨氧化過程的電子傳播途徑有重要意義[30-32]，這些分子水平上的差異可能是導致2類氨氧化微生物對不同類型的BNI表現出不同響應的主要原因。通常單加氧酶有1個底物范圍，AMO也不例外，AMO可用的底物有近60種化合物，這60種底物通過3種不同的機制來影響AMO活性。HAO催化水解羥胺，是發生在能量氧化過程中羥胺到亞硝酸鹽反應的一步。生物硝化抑制劑通過抑制AMO和HAO的活性來抑制硝化作用（圖1）[33-34]。有研究表明，生物硝化抑制劑可以干擾氨氧化過程中HAO到輔酶和細胞色素的電子傳播途徑[35]。氨氧化細菌和氨氧化古菌屬于專性化能自養型微生物，放線菌、微藻類、細菌、真菌等異養微生物也可進行異養硝化作用，但對硝化作用的貢獻較小。

2.2 生物硝化抑制劑的種類

非洲濕生臂形牧草和俯仰臂形草根際所產生的亞油酸、α-亞麻酸和不飽和脂肪酸含有BNI活性，這3種化合物可以同時抑制AMO和HAO的活性，但對AMO的抑制效果更高，且作用時間可達數月[36]。其他具有相似功能的植物對AMO和HAO活性的抑制效果相近[36-37]。目前已知具有釋放BNI能力的植物如表1[34]所示，臂形牧草和高粱對AMO和HAO都有抑制作用，而水稻僅對AMO有抑制作用（圖1）。

Byrnes等研究了2種具有不同硝化抑制能力的非洲濕生臂形牧草，將2種分泌BNI能力不同的非洲濕生臂形牧草種植 29 d（施入的總N量為1.49 g/kg;土壤pH值為6.2），分別測定了種植前后根際土的硝化速率并用定量PCR法檢測了AOA和AOB的拷貝數;結果表明，種植較低抑制能力臂形牧草（Brachiaria humidicola cv. Mulato，簡稱BM）土壤的N2O排放量為80 mg/m2，而種植了較高抑制能力臂形牧草（Brachiaria humidicola cv. Tully，簡稱BT）的土壤僅為 32 mg/m2，BT根際土中硝化、反硝化作用和AOA豐度明顯低于BM，說明抑制能力較強的牧草對抑制AOA活性起主導作用[27]。基因可遺傳變異是分子育種改變植物基因型的前提，非洲濕生臂形牧草釋放BNI的能力是存在遺傳變異性的。

Subbarao等研究發現，高粱根際釋放出2種硝化抑制劑：一種抑制劑是親水型化合物;另一種抑制劑是疏水型化合物，2種BNI的釋放速率范圍是10～25 ATU/（g·d）。在種植了30 d高粱的盆栽試驗里，土壤BNI增加了10 ATU/g，有效地使硝化作用降低了40%;對親水性的BNI進行鑒定發現，其主要化合物為野櫻素（sakuranetin），而疏水性的BNI主要成分為1種帶有苯環的脂肪酸化合物（sorgoleone），這2種化合物可以同時抑制羥胺氧化和氨氧化過程[38]。高粱在整個生長過程中釋放生物硝化抑制劑的能力隨高粱生長不斷提高，但是生物硝化抑制劑的抑制效果卻隨著高粱的生長不斷降低;高粱分泌親水性和疏水性生物硝化抑制劑的量沒有明顯差別，唯一的區別是在高粱生長130 d后，根部釋放親水性抑制劑的量有明顯的下降[38]。周金泉對高粱分泌的一種BNI——對羥基苯丙酸（MHPP）進行研究發現，MHPP的分泌速率隨著銨離子濃度的升高而增加;利用對質子泵具有激活作用的殼梭孢菌素（fusicoccin）和抑制劑釩酸鹽（vanadate）處理高粱根系后發現，殼梭孢菌素能提高MHPP的分泌量，而釩酸鹽則導致其分泌量降低[39]。

Sullivan對96個的小麥品種進行研究發現，其中26個小麥品種能分泌BNI，使硝化速率平均降低38%;將這26種小麥和非洲濕生臂形牧草抑制硝化速率的能力作比較，結果發現，非洲濕生臂形牧草可將硝化速率降低14%，而26種小麥中有20種的硝化抑制效果優于非洲濕生臂形牧草，其中效果最優的可將硝化速率降低79%[30]。此外，具有分泌BNI能力小麥的根際土硝化潛勢降低了25%～45%。

Sun等對19種具有抑制硝化能力的水稻進行研究，并從中提取到1種新型的BNI——1，9-癸二醇。1，9-癸二醇是水稻根系分泌的天然物質，對灰土中硝化作用有明顯的抑制能力，其主要通過抑制AMO活性來降低硝化作用，其抑制效果顯著大于農牧業生產中普遍使用的硝化抑制劑DCD。但目前無法確定微生物是否能產生s-1，9-癸二醇，或是在某種程度上降解1，9-癸二醇。在水稻中，發現了與非洲濕生臂形牧草相似的編碼生物硝化抑制劑的基因[40]。

2.3 生物硝化抑制劑分泌的因素影響

NI和BNI的有效性可能受到若干土壤和環境因素的影響。其中最重要的影響因素為以下幾個方面：（1）抑制劑本身具有物理、化學特性（特別是其結構、C鏈長度和容易降解的官能團結構等），不同的抑制劑具有不同的水溶性和流動性，且被土壤礦物質和有機制吸附的程度也不同;（2）土壤物理性質（黏土含量、土壤類型）、化學性質（pH值）和微生物特性（微生物活性和多樣性）等[41];（3）溫度和土壤水分條件。環境因素會極大地影響抑制劑的持久性、降解性和有效性。例如，熱帶土壤的高溫不僅增加了土壤硝化率，還增加了NI的降解率[42]。此外，土壤含水率不同對NI的降解和有效性的影響不同[43]。在土壤植物系統中，有大量的數據顯示BNIs的存在及其作用機制。因此，加強對不同土壤類型和農業氣候條件下，BNI在土壤-植物系統中的持久性和有效性研究，將有助于BNI在農業生態系統中的應用[44]。

氮素類型（銨態氮或者硝態氮）對植物根際分泌BNI有很大的影響。不同氮素形態下高粱分泌BNI的能力并不相同[33]，張瑩等通過pH值自動調節系統在pH值為3、7的沙培營養液中分別用銨態氮和硝態氮培養高粱幼苗，結果發現，硝態氮條件下培養的高粱BNI釋放能力為 10 ATU/（g·d），而銨態氮處理下的高粱BNI釋放能力為30 ATU/（g·d）[45]。植物根際釋放BNI表現出很強的生理機能，這種生理機能與攝取銨態氮有關，例如隨著銨態氮的攝入，質膜輸入H+的活躍程度增加，根區被酸化，進而使根際BNI的分泌量提高。另外，根系分泌的BNI具有局部性特點，BNI的釋放僅限于周圍含有銨態氮的根際，而其他部分的根際則不釋放BNI，這種局部性保證了在銨態氮活躍的根區常常伴有高濃度的BNI[46]。從銨態氮對BNI排放的影響出發，防止銨態氮被氨氧化微生物利用可以作為改善BNI能力的關鍵方法，此方法有待進一步研究。

根區pH值也會影響植物根際BNI的排放。最新研究表明，當pH值>7時，即使高粱在銨態氮含量很低的土壤環境下生長，根際也不會分泌BNI;當pH值=或≈7時，高粱根際近80%釋放親水型BNI的能力被抑制，當pH值為5～6時，高粱根際分泌BNI的活性最高;但BNI一旦被根際釋放出來，就不會隨著pH值改變而發生變化[6]。植物BNI的活性隨著根系分泌氫離子濃度的增加而增強，這也許是植物在銨態氮營養下防止銨態氮被氧化的1種重要機制。可以通過調節土壤pH值來提高植物根際BNI的分泌能力;例如，黑土（pH值>7）有較強的緩沖能力，很難降解根際土壤的pH值[46]，這樣類型的土壤也許不適合高粱根際分泌BNI功能的表達，而具有低緩沖能力，適度的酸性土壤（pH值<6）更適合高粱BNI能力的表達[6]。也有研究表明，BNI可能是一類有機陰離子，所以根際pH值變化和BNI本身無關[39]。因此，是否可以通過改變土壤pH值來間接提高高粱分泌BNI的能力有待進一步研究。綜上所述，從這些影響因素出發來提高植物分泌BNI的能力可能是提高氮素利用率的一種重要機制，相關研究還有待進一步深入。

3 生物硝化抑制劑與農業生態

據聯合國糧食及農業組織（FAO）統計，在1950—1970年，世界糧食總產量增加近1倍，其中因谷物播種面積增加的產量占22%，因播種面積提高的產量占78%。西方及日本科學家一致認為，糧食增產有40%～65%是增加化肥的施用量引起的。隨著農業生產的發展，我國的化肥施用量逐年增加，目前總量已居世界第1位[37]。1977—2005年，我國的糧食年產量從28 300萬t增加到48 400萬t，產量增加近71%;但是氮肥的施用量卻從707 t增加到2 621 t，施用量增加了270.7%[31]，而大量的氮肥施用往往伴隨著氮素的流失和環境污染[47]。此外，大量復合肥的施用刺激了畜牧業的發展和化石燃料消費的增長，然而這也破壞了生物地球化學的氮循環，造成了地表水污染、酸雨、土壤酸化、溫室氣體排放等一系列的環境問題，同時也影響著人類健康[48-49]。因此，提出切實可行的農業減排措施對改善生態環境有重要意義。

生物硝化抑制劑可以在農業上降低硝化速率[38]，雖然不能提高植物本身對氮的吸收能力，但延長了氮元素以銨態氮的形式在根際的停留時間，由于銨態氮的移動性比硝態氮低[50]，所以生物硝化抑制劑也可為植物提供了更多的時間利用氮素，從而減少氮淋失和反硝化的總量[51-52]。Subbarao等研究了不同植物根際對硝化反應的影響，結果表明，與大豆的對照試驗相比，非洲臂形草處理的N2O排放量減少了90%[34]。也有研究通過蔬菜田間試驗來對比人工合成硝化抑制劑和生物硝化抑制劑對土壤排放N2O和CH4的影響，結果表明，尿素+化學硝化抑制劑（CP）和尿素+生物硝化抑制劑（BNI）這2個處理之間土壤的CH4排放量無顯著性差異，但是N2O排放量每年分別降低16.5%、18.1%[11]。

4 生物硝化抑制劑的產業化生產和應用前景

生物硝化抑制劑能明顯降低全球增溫潛勢和溫室氣體排放強度。與尿素處理相比，生物硝化抑制劑可使全球增溫潛勢和溫室氣體排放強度分別下降10.1%和17.6%。在比較人工合成硝化抑制劑和生物硝化抑制劑效果的熱帶稻田試驗中，與施用尿素的處理相比，生物硝化抑制劑能降低全球增溫潛勢，而人工合成的硝化抑制劑能顯著降低全球增溫潛勢[52]。

硝化和反硝化過程是硝態氮和NO、N2O產生的主要過程，因此抑制硝化作用的關鍵在于降低N2O的排放和硝態氮的產生。Philippot等發現，在一些存在生物硝化抑制能力的谷物和草類中，可以利用基因改良的方法（如標記輔助育種、代謝工程）使下一代擁有抑制硝化作用的能力[53]。有研究者成功地將高BNI表達能力的野生型小麥基因導入到無明顯分泌BNI能力的栽培小麥中，使其獲得了高BNI分泌能力[44]。這些研究使培育具有BNI分泌能力的下一代栽培品種成為可能。雖然此方法可能會對土壤氮排放量的降低產生重大影響，但外來帶有不同性狀位點的染色體可能會使基因改變，進而造成谷物的減產[44]。雖然關于BNI的應用和品種改良研究尚處于初級階段，但利用已發現的生物硝化抑制劑來改良已有的化學合成抑制劑產品將會是今后1個重要的研究方向。Sun等在對水稻分泌BNI能力的研究中已經發現1種新型的抑制劑1，9-癸二醇[40]，能否將這種抑制劑產業化生產還需進一步研究。

5 展望

隨著對BNI研究的深入，越來越多的試驗證明了多種植物根系具有分泌BNI的能力。目前，國內外對BNI的研究還停留在其來源、種類和作用等方面，而未來對BNI的研究，應用新技術、新方法，結合不同土壤生態系統和農業系統的特性，重點圍繞以下幾個方面展開：

（1）從保護環境出發，提供施用氮肥的新方法和范例[54]。把生物硝化抑制劑作為一種有效手段來抑制硝化作用，結合多種學科來研究水稻、高粱等禾本科植物根系分泌BNI的能力。

（2）利用分子生物學等手段，使已發現的生物硝化抑制劑分泌的功能基因在谷物系統中進行表達，降低農業系統中硝化作用。將農業生產在高硝化和低硝化生產系統中找到平衡，更好地對氮肥施用進行管理，從而在滿足農業生產需求的同時調控農田土壤溫室氣體的排放。

（3）關于BNI對農田N2O的排放影響目前多停留在研究階段，今后可對BNI的分子結構等進行系統性研究，為BNI提取及其產業化生產提供理論依據和切實可行的技術支持。

（4）目前所發現的對無機氮具有轉化能力的異養微生物僅存在于一些硝化作用較弱的酸性森林土壤或含水率較高的土壤中，生物硝化抑制劑對異養微生物的硝化過程是否有抑制作用有待進一步研究。

（5）我國對于生物硝化抑制劑的研究才剛剛開始，作為農業大國，如何更好地處理氮肥使用所帶來的環境污染問題一直備受關注。將生物硝化抑制劑更好地與我國農田系統相結合是今后重要的研究方向。我國谷物類農作物的生物硝化抑制功能也需要進一步研究，對于已經發現的高粱、水稻等作物的生物硝化抑制能力，如何更好利用現代技術，將其應用到我國的農業系統中也是今后研究的重點方向。

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