鹿茸多肽研究進展

張玲鶯 李墨翰 李乳姝 鄭艷 楊梅 武俊瑞 烏日娜 岳喜慶

摘 要：鹿茸多肽占鹿茸總濕質(zhì)量的50%～60%，是鹿茸中最為重要的生理活性物質(zhì)之一。本文結(jié)合前人研究成果，綜述鹿茸多肽的化學(xué)成分、提取方法和分離純化方法，著重介紹鹿茸多肽對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)的作用及其抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，并對鹿茸多肽的發(fā)展趨勢及研究前景進行展望。

關(guān)鍵詞：鹿茸多肽;化學(xué)成分;提取方法;分離純化方法;生理作用

Abstract： Velvet antler polypeptides account for 50% to 60% of the total wet mass of velvet antler and are one of the most important physiologically active substances in velvet antler. This article presents a systematic review of previous studies on the composition of velvet antler polypeptides and the methods used to extract and purify them， with focuses on their effects on the immune system， nervous system， cardiovascular system and skeletal system and theiranti-fatigue， antioxidant， anti-tumor and other biological activities. Moreover， future trends and research prospects are discussed as well.Keywords： velvet antler polypeptides; chemical composition; extraction methods; separation and purification methods; physiological effects

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033

中圖分類號：R282.74? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）06-0064-06

引文格式：

張玲鶯， 李墨翰， 李乳姝， 等. 鹿茸多肽研究進展[J]. 肉類研究， 2019， 33（6）： 64-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033.

http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Lingying， LI Mohan， LI Rushu， et al. Progress in research on velvet antler polypeptides[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 64-69. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-033.? ? http：//www.rlyj.net.cn

鹿茸是脊椎動物門哺乳綱鹿科動物馬鹿（Cervuselaphus linnaeus）或梅花鹿（Cervus nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者稱馬鹿茸（青毛茸），后者稱花鹿茸（黃毛茸）[1]。鹿茸作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥之一，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有兩千多年的使用歷史。馬鹿與梅花鹿作為我國鹿茸資源的主要來源品種，在我國的分布十分廣泛。馬鹿分為8 個亞種，分別為阿爾泰亞種、阿拉善亞種、東北亞種、甘肅亞種、四川亞種、塔里木亞種、天山亞種和西藏亞種[2]。梅花鹿分為6 個亞種，分別為東北亞種、華北亞種、華南亞種、山西亞種、四川亞種和臺灣亞種。馬鹿與梅花鹿東北亞種的道地產(chǎn)區(qū)主要為吉林省和黑龍江省，其飼養(yǎng)量約占全國的1/2。據(jù)統(tǒng)計，目前鹿茸全球生產(chǎn)量每年接近1 300 t[3]。作為一種特殊的軟骨組織和可連續(xù)再生的哺乳動物器官，鹿茸中含有多種活性因子，化學(xué)成分較為復(fù)雜且含有多種有機和無機成分，主要為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、維生素、激素、膠質(zhì)、脂類、黏多糖、堿基、核酸、芳香族化合物、酶類、多胺、微量元素及其他無機物等[4-5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，鹿茸的化學(xué)成分較為復(fù)雜，具有廣泛的生理作用，如對免疫系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、骨代謝及糖代謝的調(diào)節(jié)作用[6-7]。鹿茸多肽作為鹿茸中的天然活性成分，占鹿茸總濕質(zhì)量的50%～60%，是鹿茸中最為重要的生理活性物質(zhì)之一[8]，因此對鹿茸多肽的研究具有重要意義。本文介紹了鹿茸多肽的化學(xué)成分、提取方法及分離純化方法，并著重介紹了鹿茸多肽對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)的作用及其抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，綜述了目前鹿茸多肽的研究進展與發(fā)展前景，以期為我國鹿茸加工行業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 鹿茸多肽的化學(xué)成分

鹿茸多肽的化學(xué)成分及構(gòu)成較為復(fù)雜，其中氨基酸是鹿茸多肽的基本組成單位。研究表明，鹿茸多肽中已檢測出7 種必需氨基酸、11 種非必需氨基酸[9-11]。不同品種、同一品種不同部位的鹿茸多肽中氨基酸含量與種類差異很大，必需氨基酸中亮氨酸和纈氨酸含量較高，非必需氨基酸中甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸的含量較高[9，11]。

同時，鹿茸多肽的分子質(zhì)量也因品種、部位、提取方式的不同而有所差異：王華等[12]采用硫酸胺分級沉淀、凝膠層析柱及高效液相色譜柱對鹿茸多肽進行提取純化，得到的多肽分子質(zhì)量小于800 Da;周秋麗等[13]采用電泳與質(zhì)譜相結(jié)合的方法，從梅花鹿鹿茸中提取出分子質(zhì)量約為1～3 kDa的多肽;王豐等[14]通過凝膠過濾、離子交換、高效液相色譜、電泳及質(zhì)譜等一系列技術(shù)手段，從馬鹿鹿茸中提取出分子質(zhì)量為3 095.1 Da的多肽;翁梁等[15]采用柱色譜及反相高效液相色譜等方法從馬鹿鹿茸中提取出一種由32 個氨基酸殘基組成（32肽）的分子質(zhì)量為3 216 Da的單體多肽化合物，但該多肽在梅花鹿鹿茸多肽組分中未被檢出，說明其極可能是馬鹿鹿茸中特有的活性物質(zhì);張鄭瑤等[11]從梅花鹿鹿茸中分離出一種新多肽，并進一步通過激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析得出該多肽的分子質(zhì)量為3 263.4 Da，氨基酸序列為VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，此梅花鹿鹿茸多肽與翁梁等[15]提取的馬鹿鹿茸多肽在結(jié)構(gòu)上較為相似，均由包含32 個氨基酸殘基的直鏈多肽組成，但第5、8、11和30位氨基酸殘基不同;嚴(yán)銘銘等[9]從梅花鹿鹿茸中分離提取出1 種分子質(zhì)量為1 479.902 8 Da的單體多肽CNT14，并使用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測得其氨基酸序列為EPTVLDEVCLAHGP;霍玉書等[16]利用分子篩從冷凍鹿茸的緩沖液提取物中分離得到的蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)分子質(zhì)量在10 kDa以上。

2 鹿茸多肽的提取工藝幾種常用的鹿茸多肽提取方法及其優(yōu)缺點如表1所示。

2.1 萃取法

有機溶劑在自然界中分布廣泛，使用有機溶劑對鹿茸多肽進行萃取不僅造價低廉、安全無毒性，而且方便后續(xù)回收和處理。乙醇常被用作萃取劑來提取鹿茸中的蛋白質(zhì)及多肽等有效成分，董萬超等[23]采用乙醇萃取法對梅花鹿鹿茸多肽進行提取，成功分離出2 種不同組分;吳慶燕等[24]分別采用乙醇和丙酮提取鹿茸多肽，并對鹿茸多肽的活性進行檢測;張展[17]采用乙醇萃取的方式提取鹿茸多肽，并證明分子質(zhì)量0.5～0.6 kDa的寡肽促進人脂肪間充質(zhì)干細胞增殖的效果最好。在我國絕大部分鹿產(chǎn)品加工廠內(nèi)，萃取法是提取鹿茸中有效成分最為普遍的手段。但是在采用有機溶劑萃取鹿茸多肽時，會對鹿茸多肽的活性造成一定的破壞，并且提取過程要始終保持低溫，增加了提取成本。

2.2 酶解法

酶解法提取鹿茸多肽不受溫度條件的限制，在對酶種類、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、酶添加量及pH值等條件進行合理分析及實驗，篩選出最佳組合后，能提取出活性更強、純度更高、產(chǎn)量更多的鹿茸多肽，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。徐明等[18]將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶兩兩組合，篩選出的最佳提取組合為溫度48 ℃、pH 7.2、底物質(zhì)量濃度7.5 g/100 mL、酶濃度6 000 U/g、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶比例1∶1、水解時間4 h，在此條件下水解度為32.5%，多肽得率為72.8%;王華等[12]考察酶用量、底物濃度和反應(yīng)時間對酶解法提取鹿茸多肽的影響，確定最佳條件為酶與底物質(zhì)量比1∶150、底物與溶劑質(zhì)量比1∶13、水解時間60 min，最終測得蛋白含量為70.45%。由此可見，酶解法提取鹿茸多肽的提取率高于萃取法，但酶解法在提取前大多需要進行醇提，且需要調(diào)控的因素過多，最佳提取條件較難確定。

2.3 超聲波法

超聲波法提取鹿茸多肽采用超聲波振動的方式，溶劑快速進入樣品中，將鹿茸多肽盡可能完全地溶解于有機溶劑中。才鳳等[25]采用超聲波法提取鹿茸多肽，經(jīng)正交試驗得出最適條件為料液比1∶10、提取3 次、提取時間10 min;朱國豐[26]對提取時間、提取次數(shù)、濃度及pH值進行優(yōu)化，篩選出的最佳條件為乙醇胺-鹽酸提取液pH值為10.0、濃度4.0 mol/L、提取時間15 min、提取7 次，在此條件下鹿茸多肽的提取率為95.31 μg/g。超聲波法提取鹿茸多肽耗時較短、成本低、適應(yīng)性廣、提取物產(chǎn)量高且提取的鹿茸多肽活性較強，因而成為目前許多鹿產(chǎn)品深加工企業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量的首選。

2.4 高壓脈沖電場法

高壓脈沖電場提取法將液態(tài)的鹿茸多肽溶液作為電解質(zhì)，利用高壓電場產(chǎn)生的高強度脈沖破壞細胞膜，改變其通透性，使細胞內(nèi)容物流出，從而達到提取效

果[27]。趙景輝等[28]利用高壓脈沖電場法提取鹿茸多肽，并經(jīng)正交試驗確定最佳組合為電場強度22 kV/cm、脈沖數(shù)8、料液比1∶12，最終鹿茸多肽的提取率為1.72%。高壓脈沖電場法提取鹿茸多肽能將提取時間縮短至1 s內(nèi)，最大程度減少多肽活性的降低，同時產(chǎn)量極高、操作便捷，未來有望成為鹿茸多肽提取的主流技術(shù)方法。

2.5 超微粉碎法

超微粉碎法指利用機器本身或流體動力將物料顆粒粉碎至微米甚至納米級超細粉末的過程。李超華等[29]研究表明，超微粉碎法提取鹿茸多肽產(chǎn)量大、含量高、神經(jīng)保護作用強，提取率高達14.892%。超微粉碎過程可在低溫狀態(tài)下進行，避免了局部過熱的現(xiàn)象，并且粉碎速度較快，粒徑分布均勻，能夠最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，有利于提高提取率。

2.6 其他方法

提取鹿茸多肽的方法有很多，但每種方法各有利弊，表1列出了幾種常用的鹿茸多肽提取方法及其優(yōu)缺點。目前很多學(xué)者采用將表1中2 種或2 種以上方法結(jié)合的手段提高鹿茸多肽提取率，如酸醇-酶解結(jié)合法[18]、勻漿-超微粉碎結(jié)合法[20]、CO2超臨界萃取法[21]等。但是由于鹿茸多肽極易受到溫度、化學(xué)試劑等因素影響而變性失活，因此對鹿茸多肽提取工藝的優(yōu)化仍有待研究。

3 鹿茸多肽的分離純化

3.1 鹽析法

鹿茸多肽在硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉等中性鹽溶液中的溶解度隨含鹽量的增加而上升，而當(dāng)含鹽量上升到一定質(zhì)量濃度時，鹿茸多肽溶解度卻不斷降低直至析出，這一過程稱為鹽析。劉唯佳[30]采用硫酸銨鹽析分級沉淀與超濾杯結(jié)合的方法對鹿茸多肽進行分離純化，提高了多肽提取率。鹽析法操作簡便，成本低廉，但在透析脫鹽過程中蛋白質(zhì)和多肽極易析出，使其變性失活。

3.2 超濾法

超濾法提取鹿茸多肽是在壓力或離心力的作用下，使小分子多肽和水通過超濾膜，而大分子物質(zhì)則被截留，從而達到分離純化的目的。郝潔[31]用超濾技術(shù)提取鹿茸中的有效成分，分別用普通聚醚砜（polyethersulfone，PES）超濾膜和改性PES膜對胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）的提取進行對比實驗，對鹿茸多肽的分子質(zhì)量、pH值、壓力和濃縮倍數(shù)等因素進行正交試驗，最終得到超濾法提取的最佳組合為分子質(zhì)量10 kDa、壓力0.3 MPa、pH 12、濃縮倍數(shù)1.25 倍，此時膜回收蛋白率為69.20%。實際操作中，樣品的密度、超濾膜的透過性、壓力及流速等條件均會對結(jié)果產(chǎn)生影響，因此要根據(jù)提取多肽的分子質(zhì)量選擇適宜的超濾膜及超濾條件。

3.3 離子交換法

離子交換色譜主要分為陽離子交換柱和陰離子交換柱，主要根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽所帶電荷的差異選擇柱型，影響離子交換色譜分離效果的因素主要有pH值、離子強度、洗脫劑等。王本祥等[32]采用離子交換色譜法從馬鹿鹿茸中提取出分子質(zhì)量為3.2 kDa的多肽，并證明其具有促進骨和軟骨細胞增殖的能力。離子交換色譜法能夠分離出純度較高的多肽，并進一步得到純度更高的肽。同時，離子交換柱可以反復(fù)使用，節(jié)約成本。

3.4 電泳法

電泳法利用帶電粒子在電場中移動速度不同而將鹿茸多肽分離出來。周秋麗等[13]對梅花鹿鹿茸多肽和馬鹿鹿茸多肽分別采用電泳法和質(zhì)譜法進行分離分析，并且對其化學(xué)組分及生物活性進行研究。結(jié)果表明，梅花鹿鹿茸多肽與馬鹿鹿茸多肽的組成差異較為顯著。電泳法設(shè)備簡單、操作方便、分辨率較高，同時還可以準(zhǔn)確、清晰地觀察到鹿茸多肽分子質(zhì)量的大小，進而能夠更加直觀地判斷各種組分的含量。

4 鹿茸多肽的生理作用

4.1 對免疫系統(tǒng)的作用

免疫系統(tǒng)主要由免疫器官、免疫細胞及免疫活性物質(zhì)構(gòu)成，免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應(yīng)免疫，其中適應(yīng)免疫又分為體液免疫和細胞免疫。研究表明，鹿茸具有較強的免疫促進功能，從而增強機體的細胞免疫和體液免疫功能，而鹿茸多肽作為鹿茸的主要活性成分，經(jīng)驗證能夠提高細胞免疫和體液免疫能力，具有明顯的免疫促進功能[33-34]。從梅花鹿中提取分子質(zhì)量為3.2 kDa的鹿茸多肽（nVAP32）用于小鼠免疫實驗，結(jié)果表明，nVAP32能顯著刺激脾細胞的增殖，增強淋巴細胞亞群的繁殖能力，同時nVAP32還顯示出上調(diào)相關(guān)細胞因子表達的顯著能力[35];進一步采用比色法評估脾細胞增殖和細胞殺傷活性表明，梅花鹿鹿茸重組多肽及其天然對應(yīng)物均能明顯刺激脾細胞增殖，提高脾細胞的增殖能力，而rVAP32也有望作為天然產(chǎn)物nVAP32的替代物研制新的生物制藥產(chǎn)品[36]。也有研究指出，鹿茸多肽可以顯著提高小鼠單核巨噬細胞的吞噬能力，加快小鼠T、B淋巴細胞的增殖，從而提高機體的免疫功能;同時，鹿茸多肽對多種急慢性炎癥均具有明顯的抑制作用，是鹿茸抗炎、鎮(zhèn)痛的主要功能成分之一[37]。Kim等[38]采用鹿茸的水溶性提取液（含有蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)）對膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠進行14 d的治療，結(jié)果表明，鹿茸提取液能夠抑制關(guān)節(jié)炎的惡化，減少骨吸收，這與Suh等[39]的研究結(jié)果相似，從而進一步證明了鹿茸多肽的免疫促進功能。另外，鹿茸多肽提取物還能夠加快皮膚創(chuàng)傷的

愈合[33]。鹿茸多肽對于免疫系統(tǒng)的促進功能為鹿茸保健食品的研發(fā)提供了新的思路，未來也有望以鹿茸多肽為主要功能成分研發(fā)出增強免疫力、提高人體細胞防御力的功能性保健食品。

4.2 對神經(jīng)系統(tǒng)的作用

神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞構(gòu)成的復(fù)雜機能系統(tǒng)，神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的基本機能單位。研究證實，鹿茸多肽可以加快胎鼠腦神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元細胞分化的過程，同時提高分化細胞的數(shù)量，促進神經(jīng)系統(tǒng)的再生作用，并且在一定使用劑量內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性[40]。Wu Feifei等[41]指出，鹿茸多肽具有能明顯改善東莨菪堿及亞硝酸鈉誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的能力。趙天一等[42]采用降支結(jié)扎法建立大鼠心肌缺血模型，實驗顯示，抑制神經(jīng)細胞凋亡蛋白的表達在鹿茸多肽高、中、低劑量組中均增加，在模型組下降;促進神經(jīng)細胞凋亡蛋白在2 組中的表達趨勢則剛好相反，說明鹿茸多肽可以通過調(diào)節(jié)抑制神經(jīng)細胞凋亡蛋白和促進神經(jīng)細胞凋亡蛋白的比值來抑制神經(jīng)細胞凋亡。也有研究證實，鹿茸多肽可以降低1-甲基-4-苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP+）誘導(dǎo)的SH-SY5Y人神經(jīng)母細胞瘤細胞損傷，起到一定程度的神經(jīng)元保護作用[43]。Zhang Lihong等[44]進一步發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽能夠在體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化，分化細胞與神經(jīng)元極為相似，并且檢測出一些特殊生長因子，如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子等，而分化的神經(jīng)元細胞可以表征為特殊的神經(jīng)分子。鹿茸對神經(jīng)系統(tǒng)及記憶力的增強作用使得日后相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)成為可能，但對相關(guān)通路的機理還有待進一步研究。同時，因鹿茸多肽對于神經(jīng)系統(tǒng)在一定使用劑量內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性，其使用安全性及毒副作用還有待進一步評估。

4.3 對心血管系統(tǒng)的作用

早在古代，鹿茸就已被用于心律失常、心衰等心血管系統(tǒng)疾病的治療。心血管系統(tǒng)是一個封閉的管道系統(tǒng)，主要由心臟和血管組成，有關(guān)鹿茸多肽對心血管系統(tǒng)作用的研究也多集中在心臟細胞與血管細胞。Xiao Xiang等[45]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對缺血缺氧條件下心臟微血管內(nèi)皮細胞的增殖、凋亡情況及線粒體膜電位檢測后發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽能夠明顯減少凋亡細胞的數(shù)量，增強心臟微血管內(nèi)皮細胞的活力和增殖能力，并通過調(diào)節(jié)對應(yīng)信號通路改善缺血缺氧誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷。Zhao Lihong等[46]用鹿茸多肽對橫向主動脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的心臟纖維化大鼠灌胃后得出，鹿茸多肽能夠破壞轉(zhuǎn)化生長因子β1與其受體的結(jié)合，阻斷血管緊張素的下游信號傳導(dǎo)，從而達到對心臟的抗纖維化作用。Zhu Wenhe等[47]對過氧化氫誘導(dǎo)損傷的靜脈內(nèi)皮細胞的線粒體膜電位、細胞內(nèi)活性氧水平及細胞凋亡相關(guān)蛋白進行檢測后發(fā)現(xiàn)，鹿茸多肽能夠顯著增強其細胞生存能力，降低細胞凋亡率，并調(diào)節(jié)過氧化氫造成的下游信號傳導(dǎo)凋亡的相關(guān)表達。目前市場上已經(jīng)出現(xiàn)以鹿茸為原料的心腦血管保健食品及藥品，但由于鹿茸多肽對心血管系統(tǒng)的作用機制并不完全明確，且對于以鹿茸多肽作為主要功能成分的靶向研究較為缺乏，因此高純度鹿茸多肽的保健功能食品或藥品仍有待開發(fā)。

4.4 對骨骼的作用

鹿茸多肽對骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用，且療效穩(wěn)定，安全性高。目前對鹿茸多肽抗骨質(zhì)疏松的研究較多：梅花鹿鹿茸多肽具有促進維A酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞增殖的作用，使骨吸收小于骨形成，起到抗骨質(zhì)疏松的效果，且當(dāng)多肽質(zhì)量濃度為20 mg/kg時，軟骨細胞和成骨細胞的增殖情況最好，骨折的愈合率最高[48];鹿茸多肽還能加快骨折大鼠骨痂的形成，促進骨痂內(nèi)骨膠原和鈣鹽的積累，改善骨折部位的生物力學(xué)性能，從而縮短骨折愈合時間，促進骨折愈合[49];Li Na等[50]基于高分離度快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，RRLC-Q-TOF/MS）