衰老性骨質疏松微環境對頜骨骨髓間充質干細胞生物學功能的影響*

李勝丹 梁乙然 劉一涵

骨質疏松癥(OP,Osteoporosis)是一類以骨密度降低、骨脆性增加、骨微結構破壞、骨折風險增加為特征的全身性骨骼疾病[1]。骨質疏松癥分為原發性骨質疏松和繼發性骨質疏松兩型。原發性骨質疏松包括絕經后骨質疏松和衰老性骨質疏松。隨著我國人口老齡化的增加，老年性骨質疏松問題愈加嚴重，不僅表現在四肢軀干骨方面，頜骨質量也直接受影響，給臨床口腔種植手術帶來困難。正常生理狀態下，成骨細胞(Osteoblast，OB)介導的骨形成與破骨細胞(Osteoclast，OC)介導的骨吸收保持平衡，以維持骨穩態。發生骨質疏松時，此平衡被打破，骨吸收大于骨形成，造成骨丟失[2]。而間充質干細胞是組織再生的基礎，在衰老性骨質疏松條件下，以往研究大多集中在四肢軀干骨來源的骨髓間充質干細胞,本文則著重研究衰老性骨質疏松微環境對頜骨骨髓間充質干細胞生物學功能的影響，并探究骨質疏松的發病機制。

1.材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 2月齡和20月齡SPF級SD大鼠(解放軍總醫院動物中心)；α-MEM培養基、胎牛血清(Gibco，USA)；PBS、青霉素、鏈霉素、胰酶、甲苯胺藍染色液、茜素紅粉劑、二甲基亞砜(索萊寶，北京)；堿性磷酸酶試劑盒、成骨誘導液(Sigma，USA)；CCK-8試劑盒(碧云天，上海)；細胞總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒(Takara，Japan)；引物(生工，上海)；CD29-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC(Biolegend，USA)；CO2細胞培養箱(Thermo，USA)；倒置相差顯微鏡及照相系 統 (OLYMPUS， Japan)； Micro-CT(Siemens，Germany)；全波長酶標儀(BioTek Instruments，USA)；RT-PCR儀器(AXYGEN，USA)；流式細胞儀(BD，USA)；離心機(Heraens Cryofuge 8000，Germany)。

1.2 自然衰老骨質疏松大鼠模型的確立 取2月齡和20月齡SD大鼠各用3%戊巴比妥鈉腹腔過量注射致死后，分離兩組大鼠頜骨及股骨，并分別進行Micro-CT掃描，觀察分析兩組大鼠頜骨和股骨骨密度及骨小梁相關指標的變化。

1.3 兩組大鼠JBMMSCs體外分離、培養和鑒定

1.3.1 JBMMSCs體外分離、培養 取2月和20月齡SD大鼠麻藥過量致死，75%乙醇消毒15分鐘，在超凈工作臺內取雙側下頜骨，仔細去除下頜骨上附麗的肌肉組織及牙槽骨中牙齒，暴露骨髓腔，取無菌60mm平皿放入5ml α-MEM培養基(置于冰上)，用1ml注射器吸取含10%血清的α-MEM培養基反復沖洗骨髓腔，于37℃，50ml/L CO2孵箱培養。48h半量換液，3天后首次全換液，以后每三天換液一次。待貼壁細胞長到80%融合后，棄培養液，PBS沖洗2次，0.25mg/mL胰酶37℃消化2min；以2.5×104/cm2密度接種傳代。取P3代細胞用于以下實驗。

1.3.2 JBMMSCs分子表型鑒定 分別取年輕、衰老大鼠生長狀態良好的P3代JBMMSCs，PBS洗2次，胰蛋白酶消化2min；1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸；調整細胞密度至1×106/ml后，分裝到1.5ml的離心管中，每管100ul。室溫下分別向每管加入 1ulCD29(PE)、CD90(FITC)、CD34(FITC)、CD45(FITC)抗體，4℃避光孵育30min；PBS洗3次，1000 r／min離心5min；PBS重懸，流式細胞儀檢測并分別計算相對應抗體陽性率(%)。

1.4 兩組大鼠JBMMSCs生物學功能檢測

1.4.1 JBMMSCs增殖能力的檢測 克隆形成實驗：分別取兩組大鼠生長狀態良好的P3代JBMMSCs，稀釋細胞濃度為5×103/ml的單細胞懸液。取1ml分別均勻接種于直徑90mm培養皿，補加7ml α-MEM培養基,十字輕輕混勻后,常規培養。每組設3個重復培養皿，10d后終止培養，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗后甲苯胺藍染色20min，dd水沖洗并拍照。鏡下觀察計數：細胞≥50個記為一個克隆，并計算克隆形成率。

克隆形成率(%)=克隆形成數量/接種細胞數量×100%

CCK-8實驗：分別取兩組大鼠生長狀態良好的P3代JBMMSCS，以2×103/孔的細胞量鋪板于96孔板，每孔加入100μl α-MEM培養液常規培養，共設置7組。接種細胞后每天取出一個96孔板，向每孔加入10μl CCK8試劑，繼續培養2h以后再次從孵箱取出，用酶標儀在450nm波長下測各孔的吸光度值(OD值)，并記錄結果。然后以OD值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.4.2 JBMMSCs成骨分化能力檢測

成骨誘導：分別取兩組大鼠生長狀態良好的P3代JBMMSCs,以1×105/ml的密度接種于6孔板中，待細胞伸展至80%融合后，換成骨誘導液(α-MEM中含5mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL維生素C、0.1μmol/L地塞米松和10%FBS)培養，每3天全換液一次。

堿性磷酸酶(ALP)染色：將兩組細胞分別進行成骨誘導，在誘導7天后用堿性磷酸酶染色試劑盒進行ALP染色，染色陽性結果是胞漿內出現藍色的沉淀，染色操作步驟如下：

①cap的fast violet B salt溶于1ml ddH2O后分裝(FVB藍)，50ul/支；

②染色前配固定液

4.9 ml ddH2O

0.1 ml檸檬酸原液(至室溫)

7.5 ml丙酮

③吸出培養基，PBS洗；

④固定30s，ddH2O輕洗45s；

⑤50ul FVB藍+2.35ml ddH2O混勻；

⑥100ul AS-MX溶液加入5中混勻；

⑦室溫30min，其染液，ddH2O洗一次，留少量水拍照；

⑧陽性結果是胞漿內出現藍色沉淀。

茜素紅染色：將兩組細胞分別進行成骨誘導21天以后，吸去原培養液，PBS反復漂洗后，用4%多聚甲醛溶液固定20min，再用配置好的茜素紅染液進行染色30min。PBS沖洗三次后，倒置相差顯微鏡下進行觀察和拍照，并對染色結果進行半定量分析。

1.4.3 Real-timePCR檢測成骨相關基因Runx2、OCN的表達 分別取兩組大鼠生長狀態良好的P3代JBMMSCs，以1×105個cell/孔的量接種到六孔板上，經成骨誘導7d后，提取細胞總RNA，檢測RNA的濃度，并反轉錄成cDNA。Runx2、OCN的引物序列參照表(表1)。PCR的反應體系為20μl，擴增條件為95℃5s、60℃30s，循環數39個。

表1 實時定量熒光PCR引物序列

1.5 統計學分析 采用SPSS22.0統計軟件對數據(±s)進行統計分析，兩組間比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2.結果

2.1 衰老性骨質疏松大鼠模型的確立 兩組大鼠經Mirco-CT掃描和圖像分析顯示:衰老組大鼠頜骨及股骨骨髓腔較年輕組空虛，骨密度明顯下降(圖1)。兩組骨小梁參數統計分析顯示:衰老組頜骨和股骨骨密度(BMD mg/mm3)、骨小梁數目(Tb.N 1/mm)均明顯低于年輕組；而骨小梁間距(Tb.Sp μm)明顯大于年輕組，兩組間各參數相比，差異均有統計學意義(P＜0.05)(圖2)。因此，衰老性骨質疏松大鼠模型確立成功。

圖1 兩組大鼠頜骨及股骨Micro-CT掃描圖像

圖2 兩組大鼠頜骨及股骨Micro-CT掃描數據分析結果(*P＜0.05)

2.2大鼠JBMMSCs的分離、培養與鑒定 鏡下觀察兩組大鼠JBMMSCs形態發現，年輕組和衰老組JBMMSCs都呈長梭形，與年輕組JBMMSCs相比，衰老組JBMMSCs細胞表面積較大，長寬比例降低(圖 3)。

圖3 兩組大鼠JBMMSCs一般形態比較(10×)

經流式細胞儀檢測顯示，年輕組大鼠JBMMSCs表面分子CD29、CD90、CD34、CD45的表達率分別為98.60%、99.50%、3.15%、4.00%，衰老組大鼠JBMMSCs表面分子CD29、CD90的表達率分別為97.4%、97.6%，略低于年輕組，CD34、CD45的表達率分別為4.91%、5.2%，略高于年輕組。結果表明兩組JBMMSCs均陽性表達干性相關分子CD29、CD90，陰性表達造血干細胞表面分子CD34、CD45，符合間充質干細胞特性(圖4)。

圖4 兩組大鼠JBMMSCs表面抗體表達結果

2.3 兩組大鼠JBMMSCs增殖能力比較 克隆形成實驗結果顯示，年輕組和衰老組JBMMSCs的克隆形成率分別為18.19%、5.99%，衰老組克隆形成率明顯低于年輕組(*P＜0.05)(圖5)。

圖5 兩組大鼠JBMMSCs克隆形成能力比較(*P＜0.05)

CCK8檢測結果顯示，衰老組JBMMSCs增殖能力較年輕組降低，培養后7d各時間點，兩組OD值相比，從培養后3～7天差異均有統計學意義(*P＜0.05)(圖 6)。

圖6 兩組大鼠JBMMSCs生長曲線(*P＜0.05)

2.4 兩組大鼠JBMMSCs成骨分化能力及成骨相關基因Runx2、OCN表達水平比較 成骨誘導7天后ALP染色結果顯示：兩組均有藍色沉淀產生，年輕組生成的藍色沉淀量高于衰老組(圖7)，且經Image J軟件半定量分析，差異有統計學意義(*P＜0.01)。

圖7 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導后ALP染色及半定量分析

成骨誘導21天后茜素紅染色結果顯示:對年輕組和衰老組JBMMSCs進行礦化誘導21天后，可見到細胞復層生長，染色后可看到明顯的礦化結節，衰老組礦化結節形成數量低于年輕組，染色也較淺(圖8)，且經Image J軟件半定量分析，差異有統計學意義(*P＜0.05)。

圖8 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導后茜素紅染色及半定量分析

Real-time PCR檢測顯示，衰老組JBMMSCs成骨誘導后其Runx2 mRNA、OCN mRNA表達水平均低于年輕組(*P＜0.05)，(圖9)。

圖9 兩組大鼠JBMMSCs成骨誘導后Runx2 mRNA、OCN mRNA表達水平(*P＜0.05)

3.討論

衰老是自然界各種生命不可抗拒的必然結果。隨著年齡的增加，機體各個器官組織功能均發生增齡性改變，尤其在骨組織中表現明顯[3]。骨質疏松癥是一種退行性疾病，其特征是嚴重的骨質流失,導致骨質疏松和骨折風險增加。年齡相關的骨質疏松癥是一種復雜的疾病，為研究此疾病，我們需要生理上相似的模型。據報道，SD大鼠超過9個月大可用于建立與年齡相關的骨丟失模型[4]，已有研究證明了雄性SD大鼠隨著年齡的增長會自然發展為骨質疏松癥[5,6]。因此，本研究選擇自然衰老20月齡SD大鼠作為衰老性骨質疏松動物模型，2月齡大鼠作為年輕組進行研究。通過對兩組大鼠頜骨及股骨骨髓腔Micro-ct掃描發現，20月齡組頜骨骨密度顯著下降，骨小梁數目也減少，而骨小梁分離度增加，與付欣等[7]的研究報道保持一致。表明我們選用的20月齡大鼠骨質疏松明顯，可以作為衰老性骨質疏松模型進行實驗。

骨髓間充質干細胞(bone-marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種紡錘形、可黏附的非造血干細胞，可以從許多組織中分離出來，具有自我更新和多向分化能力，可以分化成各種中胚層細胞類型，比如成骨細胞，成軟骨細胞和脂肪細胞[8]。在骨重建時，BMSCs募集隨后增殖，譜系承諾，譜系特性標記物表達，膠原蛋白分泌和細胞基質礦化，此連續級聯的生物過程驅動了骨的形成[9]。有學者研究表明，老年小鼠來源的BMSCs的數目、增殖能力與年輕小鼠來源的相比明顯降低[10]。當MSC發生衰老時，其成骨分化能力下降而成脂能力增強[11,12]，提示我們BMSCs的生物學功能下降可能是導致骨衰老退行性變的重要原因。然而，頜骨與四肢軀干骨胚層來源及成骨方式均不同，前者來源于外胚間充質，成骨方式是膜內成骨，后者來源于中胚層，成骨方式為軟骨內成骨[13～15]。有學者研究報道，頜骨骨髓間充質干細胞的牙槽骨原位成骨能力要高于四肢軀干骨[16]。在衰老性骨質疏松條件下，頜骨骨髓間充質干細胞的增殖、分化能力將如何變化目前尚未見報道。本實驗對此展開了針對性研究，研究結果顯示，自然衰老大鼠JBMMSCs的增殖、成骨分化能力均較年輕大鼠明顯下降，表明自然衰老骨質疏松微環境下JBMMSCs生物學功能發生改變。

Runx2是成骨分化過程中的關鍵調控因子，有研究表明，Runx2缺失的鼠的成骨細胞分化完全被抑制，既不能骨膜內成骨，也不能軟骨內成骨[17]。OCN由成骨細胞分泌，作為成骨細胞活動的重要標志[18]。我們分別對Runx2和OCN的表達進行了檢測，結果顯示Runx2和OCN在衰老組的表達明顯低于年輕組，與前面染色結果一致。表明自然衰老骨質疏松微環境可能通過影響成骨相關關鍵基因的表達而影響了JBMMSCs的成骨分化功能。

本實驗結果表明，JBMMSCs隨著增齡其生物學功能發生改變，主要表現為其增殖能力、成骨分化能力降低，這可能是導致衰老性骨質疏松的重要原因，但其具體分子調控機制尚不清楚，有待我們進一步研究，為延緩和治療衰老性骨質疏松提供重要依據。