響應曲面法優選人參葛根煎膏醇沉工藝

叢 婧，王秀麗

（1.北京典奧中衛醫藥科技有限公司，北京 100054； 2.北京中醫藥大學，北京 102488）

保健食品不以疾病治療為目的，可調節機體功能[1]，符合傳統醫學的“未病先防”理念[2]，近年來得到了規范化發展。人參葛根煎膏是擬開發的一款以人參、葛根等為原料的保健食品制劑。產品水提液中含有淀粉等成分，濃縮成清膏放冷后易成糊狀，影響成品質量，需對提取液進行醇沉。為確保工藝的合理，需對醇沉工藝進行優選。本試驗中以沉淀率和濃縮膏總皂苷含量為評價指標進行工藝優選[3-4]。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

D100B型數顯定時恒流泵（上海青浦瀘西儀器廠）；DHG-9055A型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器廠）；DTG系列超聲波清洗機（鼎泰<湖北>生化科技設備有限公司）；SE402F型電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；MS204TS/00型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Q/IROE-07-201型微量移液器（1 000 μL，上海求精生化試劑儀器有限公司）。

1.2 試藥

無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠，批號為20170503）；冰乙酸（分析純，天津市富宇精細化工有限公司，批號為20170715）；Amberlite? XAD-2大孔樹脂(Ballancom chemical Co.)；中性氧化鋁（100 ～200 目，層析用 FCP，國藥集團化學試劑有限公司，批號為20170110）；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量93.4%）；香蘭素（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20160326）；高氯酸（上海桃浦化工廠）。

2 方法與結果

2.1 總皂苷含量測定

試樣處理：取人參皂苷Re對照品0.010 1 g，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得每1 mL含人參皂苷Re 0.969 6 mg的人參皂苷Re對照品溶液。取香草醛0.5 g，精密稱定，加冰乙酸溶解并定容至10 mL，即得5%香草醛-冰乙酸溶液，使用前新制。

線性關系考察：精密吸取人參皂苷Re對照品溶液50，100，150，200，250μL，分別加入 5 支錐形瓶中，60℃熱風揮干溶劑，用0.5 mL移液管各準確加入新鮮制備的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60℃恒溫加熱10 min，取出，流水冷卻2 min，準確加入冰醋酸5 mL，充分搖勻，隨行試劑空白，按紫外分光光度法，在560 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標、人參皂苷Re進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3.534 4X-0.005 4，R2=0.999 3(n=5)。結果表明，人參皂苷Re進樣量在58.17～407.20 μg范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2 響應曲面優選試驗

水提醇沉是中藥制藥重要除雜方法，醇沉的醇體積分數多選50% ～70%[5-6]，且為主要影響因素，醇沉時間多選1 d，因隨時間的延長，變化趨于平穩，故本試驗設計醇沉時間為20～28 h[7-9]。采用響應曲面優選設計（JMP軟件），以醇沉濃度和時間為影響因素，確定水提醇沉工藝最佳區域。因素設計見表1，試驗數據見表2。

表1 試驗設計因素表

表2 試驗數據表

取相對密度為1.10～1.15（60℃）的煎膏水提濃縮液。13份樣品做醇沉試驗，按表1安排響應曲面試驗，各取80 mL樣品，在一定量程的量筒中醇沉，達到規定的醇沉體積分數和時間后，記錄醇沉后上清液體積(V1)，并吸取一定體積(V2)的上清液，減壓濃縮（60～70℃，-0.06～0.08 MPa）去醇，放置表面皿中預凍，冷凍真空干燥12 h后稱質量為m1，80 mL濃縮液的固形物總質量為m0，折算出沉淀量，按下列公式計算沉淀率。醇沉后將上清液收集濃縮至相對密度為1.20～1.30（60℃測），以此樣品測定總皂苷含量。

2.3 數據分析

方差分析：結果見表3和表4。

表3 沉淀率方差分析結果

表4 總皂苷含量方差分析結果

模型適用性分析：模型擬合是否合適，需依據預測值與實際值的擬合情況判斷。由圖1可見，代表實測值的黑點均布于預測值兩側，P<0.05表示模型擬合合適。

工藝優選結果：由圖2 C響應曲面等高線圖的白色區域給出的為最佳操作區域可見，醇沉體積分數為58%～65%，醇沉時間為 22～28 h，總皂苷含量為3.75% ～4.05%，雜質去除率為76% ～78%。經計算，最佳操作點條件為醇沉體積分數60%，醇沉時間28 h，總皂苷含量最大值為4.08%，沉淀率最大值為77.58%。考慮到實際生產排班習慣，在以后的生產中擬取60%乙醇醇沉24 h為操作條件，預測總皂苷含量為3.80%，沉淀率為76.88%。

2.4 工藝驗證

按優選工藝條件，重復操作3次，取平均值，并進行工藝驗證。結果見表5。可見，工藝穩定性和重復性均良好。

3 討論

中藥水提液精制工藝中醇沉法較常用，可澄清提取液、減少服藥量和去除雜質等，操作過程簡單、溶劑安全性高、除雜效果好[10]。醇沉工藝選用適宜體積分數的乙醇，可有效沉降糊化淀粉、黏液質、蛋白質等雜質。多選用50% ～60%乙醇去除蛋白質、無機鹽類雜質[11]。乙醇體積分數是醇沉的主要影響因素[7]，合理加以控制，系統地對醇沉工藝進行優選，可避免制劑中有效成分流失。醇沉體積分數對沉淀率和浸膏中總皂苷含量影響較大，隨前者增加，后兩者均先增大后減小，這與總皂苷的溶解度和雜質蛋白質與淀粉的溶解度有關，醇沉時間因素的影響則相對較小。

圖1 預測值區間散點圖

圖2 響應曲面和優選等高線圖

表5 工藝驗證試驗結果（%）

目前中藥類保健食品中提取、醇沉工藝研究多選用單因素試驗、正交設計試驗對提取工藝進行優化篩選。其中，單因素試驗次數多，并未考慮因素之間的交互作用，使得其成本較高；正交設計試驗應用較普遍，可得出各因素間的交互作用及可能的影響趨勢。響應曲面法[12]是優化隨機過程的統計學方法，建立連續變量曲面模型，尋找試驗指標與各因子間的定量規律，找出各因子水平的最佳組合。其在多元線性回歸的基礎上主動收集數據，以獲得具有較好性質的回歸方程。建立的多維空間曲面較接近實際情況，近年來研究應用實例較多，所需要的試驗組數相對較少，優化工藝效果較優[13]，且不同于正交試驗，只能在設定的條件中選擇。

本研究中選取的產品是以人參、葛根等為主要原料制成煎膏，以水提醇沉工藝成型，為確保產品的質量，綜合考慮產品標志性成分總皂苷含量、沉淀率等因素，利用JMP軟件可視化能力強的特點，研究水提醇沉工藝最佳條件，結合模型擬合，確定以60%乙醇醇沉24 h，制得的煎膏符合最終產品質量標準。