氧氟沙星膠囊微生物限度檢查方法的建立*

曹寒梅 ，蔡 虎 ，楊曉莉 ，常 春 ，傅 強(qiáng) △

（1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061； 2.陜西浩瀚管理技術(shù)咨詢有限公司，陜西 西安 710065；3.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 咸陽(yáng) 712046； 4.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065）

氧氟沙星為第3代喹諾酮類抗菌藥物，對(duì)需氧革蘭陰性桿菌、腸桿菌科、假單胞菌屬、支原體、衣原體、非典型分枝桿菌等均有良好的抗菌活性，尤其對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性最強(qiáng)。對(duì)氧氟沙星膠囊進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，需要消除樣品的抑菌活性，真實(shí)地反映其微生物污染情況，防止出現(xiàn)假陰性檢查結(jié)果。本研究中依照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》[1]進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，利用氯化鎂與喹諾酮類抗菌藥物的絡(luò)合作用及聚山梨酯80的中和作用，通過薄膜過濾法，在稀釋劑、沖洗液、培養(yǎng)基中添加氯化鎂及聚山梨酯80消除抑菌活性，建立氧氟沙星膠囊的微生物限度和控制菌大腸埃希菌的檢查方法[2-3]。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus sub-tilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，大 腸 埃 希 菌 （Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，工作用菌株均為第3代。

儀器：LDZX-30KBS型壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；XY500JC型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；HFsafe-1800TEⅡB2型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BSD-TX345型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；HH-系列電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱、MJ 250FI型霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；FC752型薄膜過濾器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司，批號(hào)為20160102）。

試藥：氧氟沙星膠囊（某制藥公司，批號(hào)為150801，規(guī)格為每粒0.1 g）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為151107）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為150824）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為151114）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)為1505252）、蛋白胨培養(yǎng)基（批號(hào)為160119）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)為 150911）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為1504162），均購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司；氯化鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20160601）；氯化鎂（天津市百世化工有限公司，批號(hào)為20150103）。

2 方法與結(jié)果[1，4-6]

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h；將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)3 d。上述培養(yǎng)物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d或直至獲得豐富的孢子，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，45℃恒溫振蕩15 min，制成1∶10(m/V)的供試液 A。取供試品10 g，加含5%聚山梨酯80的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至90 mL，再加入10 mL 1 mol/L的氯化鎂溶液，45℃恒溫振蕩15 min，制成1∶10(m/V)的供試液B。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法：采用薄膜過濾法。試驗(yàn)組，取2.2項(xiàng)下供試液A、供試液B各1 mL，置含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的薄膜過濾器中，濾過，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分別試驗(yàn)沖洗5次、8次，每次100 mL。在最后一次沖洗液中分別加入菌落數(shù)不超過100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液各1 mL。制備好的濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上。供試品對(duì)照組，取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液，同試驗(yàn)組操作。菌液對(duì)照組，取不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組方法操作。中和劑對(duì)照組，取相應(yīng)量稀釋液替代供試品，同試驗(yàn)組方法操作。各組每株菌平行制備2皿，30～35℃培養(yǎng)2～3 d。計(jì)算平均菌落數(shù)，結(jié)果見表1和表2。

霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法：采用平皿法。試驗(yàn)組，取2.2項(xiàng)下供試液A分裝于2個(gè)無菌試管中，每管裝量9.9 mL，再分別加入制備好的含菌量不大于104cfu/mL的白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液各0.1 mL。取制備好的試驗(yàn)組樣品液1 mL，置直徑為90 mm的無菌平皿中，注入溫度不超過45℃熔化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基約20 mL，混勻，凝固，每株菌平行制備2皿，20～25℃培養(yǎng)3～5 d。同法測(cè)定供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組及中和劑對(duì)照組，并計(jì)算各組的平均菌落數(shù)。結(jié)果見表3。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的回收結(jié)果

表2 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法回收結(jié)果

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的回收結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)[7-9]

試驗(yàn)組：取供試液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的濾器中，混勻，薄膜過濾，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液分別沖洗3次、5次、8次，每次100 mL。濾完，取出濾膜，接種至300 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，各接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大腸埃希菌菌液，混勻，35℃培養(yǎng)18 h。同法取供試液A 10 mL，加入含100 mL 1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液的濾器中，混勻薄膜過濾，用含1%聚山梨酯80的0.1%蛋白胨水溶液沖洗3次，每次100 mL。濾完，取出濾膜，接入至90 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，再加入10 mL 1 mol/L的氯化鎂溶液，接入1 mL含菌量不大于100 cfu的大腸埃希菌菌液，混勻，35℃培養(yǎng)18 h。取上述各培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基，42℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)18 h。陰性對(duì)照試驗(yàn)：以稀釋液代替供試液，照相應(yīng)控制菌檢查方法檢查。結(jié)果見表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法不同培養(yǎng)基不同體積的結(jié)果

由表1至表3可見，含5%聚山梨酯80或/和含有氯化鎂的中和劑對(duì)照組的回收比值在0.5～2.0范圍內(nèi)，說明5%聚山梨酯80或/和含有0.1 mol/L氯化鎂的中和劑對(duì)試驗(yàn)菌株無毒害作用。由表1及表2可見，氧氟沙星膠囊對(duì)細(xì)菌的抑制作用很強(qiáng)，采用含聚山梨酯80的中和劑，沖洗800 mL時(shí)，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收比值均小于0.5，不能消除氧氟沙星膠囊對(duì)3種細(xì)菌的抑制作用，當(dāng)在含聚山梨酯80稀釋液中再添加氯化鎂時(shí)，沖洗800 mL，可使金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均大于0.9，表明可采用該方法作為需要菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法。由表3可見，氧氟沙星膠囊對(duì)白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用較弱，可采用含5%聚山梨酯80中和劑的常規(guī)法（1 mL/皿，10-1）作為霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法。由表4可見，當(dāng)沖洗量為800mL且加大培養(yǎng)基體積為300 mL時(shí)，亦無法消除氧氟沙星膠囊對(duì)大腸埃希菌的抑制作用。當(dāng)沖洗量為300 mL時(shí)，濾過后，將膜接入含10 mL 1 mol/L氯化鎂的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，即可檢出陽(yáng)性試驗(yàn)菌大腸埃希菌，且陰性對(duì)照試驗(yàn)無菌生長(zhǎng)。說明該方法可作為控制菌大腸埃希菌的檢查方法。

3 討論

氧氟沙星膠囊對(duì)霉菌和酵母菌抑制作用較弱，因此霉菌和酵母菌總數(shù)采用常規(guī)平皿法即可。在預(yù)試驗(yàn)中，需氧菌以常規(guī)法試驗(yàn)，供試液稀釋到1∶100（m/V）時(shí)，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的回收比值皆為0。由此可見，氧氟沙星膠囊對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑菌活性，遂在薄膜過濾法過程中采用了最后一次沖洗時(shí)加入試驗(yàn)菌的方法，并取制備的1∶10供試液1 mL或10 mL加入含100 mL沖洗液濾器中，混勻后過濾，可有效防止藥物顆粒堵塞薄膜。在中和劑的選擇上，第一，氧氟沙星膠囊有較強(qiáng)的抑菌活性，首選添加聚山梨酯80，因?yàn)橐欢舛鹊木凵嚼骢?0能促進(jìn)膠囊劑的乳化與分散，并對(duì)抑菌活性有中和作用；第二，氧氟沙星膠囊為喹諾酮類抗菌藥物，可與金屬離子（Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+，Al3+）發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使抗菌活性下降。試驗(yàn)中選擇1%1 mol/L氯化鎂和5%聚山梨酯80作為中和劑加入供試液中及1%聚山梨酯80加入沖洗液中。結(jié)果表明，在制備供試液中添加一定量的氯化鎂并采用薄膜過濾法，對(duì)需氧菌的抑菌活性有明顯的減弱作用，且在控制菌大腸埃希菌檢查的方法適用性試驗(yàn)組中，增大培養(yǎng)基體積和增加沖洗都不如在增菌培養(yǎng)基中直接添加氯化鎂消除抑菌效力作用明顯。在日后的探索中，可以嘗試將金屬離子中和劑直接添加至瓊脂培養(yǎng)基中，探索效果是否更佳，且可探索消除該類產(chǎn)品抑菌活性的金屬離子的最低有效濃度[10-11]。