注射用甲磺酸左氧氟沙星無菌方法學研究

閔 紅，謝毓華，賈 萌，楊曉莉

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

注射用甲磺酸左氧氟沙星為喹諾酮類廣譜抗菌藥物，其為氧氟沙星左旋體，抗菌活性約為氧氟沙星的2倍，抗菌譜廣、抗菌作用強，但對厭氧菌抗菌作用較差。2015年版《中國藥典（四部）》通則1101無菌檢查法[1]136-140規定，藥品進行無菌檢查前，應首先進行方法適用性試驗，以確定其適宜性，避免造成微生物漏檢。因為大部分藥品對微生物有一定的抑菌性，特別是抑菌性很強的抗菌類藥品，受微生物污染后，微生物受其抑菌性的影響不能正常繁殖，細胞受損傷但并未死亡，服用該藥品后，藥品在患者體內的抑菌性逐漸減弱，受損微生物逐漸復蘇并進行正常繁殖，從而對患者造成危害[2]。常規方法無法檢出藥品污染微生物情況，只能通過稀釋液或培養基稀釋、薄膜過濾、加中和劑或滅活劑等方法消除藥品的抑菌性后才可充分檢出污染微生物。本研究中參考2015年版《中國藥典（四部）》[1]140-144、第41版《美國藥典》、第9版《歐洲藥典》、2016年版《日本藥局方》的微生物計數法對注射用甲磺酸左氧氟沙星進行無菌方法學研究，以提高藥品的無菌檢出率。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：HTY-601型集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）；SHINVLMQC型壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；WGP-600型恒水式電熱恒溫培養箱（重慶萬達實驗儀器廠）；LRH-250型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HFsafe-760S型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；PB-10 pH酸度計（德國Sartorius公司）；渦旋振蕩儀（德國IKA公司）；DGB220型薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司）。

試藥：注射用甲磺酸左氧氟沙星注射劑[陜西博森生物制藥股份集團有限公司，批號為20170428-5，規格為0.3 g（以左氧氟沙星計）]。

培養基與沖洗液：硫乙醇酸鹽流體培養基（FTM，批號為20180418），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為20180630），沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為180916），沙 氏 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養 基 （SDA，批 號 為170316），0.1% 蛋白胨水溶液（批號為 20170602），均購于北京陸橋技術有限責任公司。

菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，生 孢梭 菌 （Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]，大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）93001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）91003]，上述標準菌株均來源于中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3代。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌株制備

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中，生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽液體培養基中，35℃條件下培養24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養基中，25℃條件下培養3 d。上述培養物用無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，25℃條件下培養7 d，加入5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用相同無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。菌液稀釋度及接種量見表1。

1.2.2 無菌方法適用性研究

試驗Ⅰ組：開啟集菌儀，取供試品20支，每支以0.1%蛋白胨水溶液約10 mL溶解，取半量導入薄膜過濾器內，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜3次，每次100mL，最后1次沖洗過程在濾膜內留少量溶液，再分別加菌落數小于100 cfu的6種試驗菌，過濾。每個培養管內灌注100 mL培養基，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌采用硫乙醇酸鹽流體培養基，白色念珠菌和黑曲霉采用胰酪大豆胨液體培養基。硫乙醇酸鹽流體培養基35℃條件下培養，胰酪大豆胨液體培養基25℃條件下培養，均培養5 d。

表1 菌液稀釋度及接種量

試驗Ⅱ組：最后一次沖洗過程在濾膜內留少量溶液，后加入 2 mL MgSO4溶液（1 mol/L），混勻，使其在濾膜上作用3 min，其余操作同試驗Ⅰ組。

試驗Ⅲ組：操作基本同試驗Ⅱ組，僅MgSO4加入量由2 mL增加至4 mL。

試驗Ⅳ組：操作基本同試驗Ⅰ組，僅沖洗液中加入5%聚山梨酯80，且沖洗濾膜次數由3次增加至6次。

試驗Ⅴ組：操作基本同試驗Ⅱ組，僅沖洗濾膜次數由3次增加至6次。

試驗Ⅵ組：操作基本同試驗Ⅲ組，僅沖洗濾膜次數由3次增加至6次。

陽性對照組：分別將菌落數小于100 cfu的6種試驗菌加入100 mL相應培養基中。

陰性對照組：不加供試液和試驗菌，按試驗組方法同法操作。

標準規定，與陰性對照組比較，試驗組和陽性對照組的試驗菌均渾濁或生長良好，可根據此方法進行該供試品的無菌檢查。若試驗組的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則應采用增加沖洗量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜等方法重新進行無菌方法學研究。

2 結果

結果見表2。可見，當采用0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜300 mL時（試驗Ⅰ組），6種試驗菌均未變渾濁；沖洗量增至600 mL并在沖洗液中添加終體積分數為5%聚山梨酯80時（試驗Ⅳ組），白色念珠菌和黑曲霉變渾濁，其余4種細菌始終澄清；當采用0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜300 mL并在最后1次沖洗過程添加2 mL濃度為1 mol/L的MgSO4時（試驗Ⅱ組），金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉均變渾濁，而大腸埃希菌始終澄清；即使將1 mol/L的MgSO4加入量增至4 mL時（試驗Ⅲ組），或沖洗次數增至6次時(Ⅴ組)，也未去除甲磺酸左氧氟沙星對大腸埃希菌的抑菌性；當采用0.1%蛋白胨水溶液600 mL沖洗濾膜并添加4 mL濃度為1 mol/L的MgSO4時（試驗Ⅵ組），大腸埃希菌變渾濁。因此，可取規定量供試品，每支同步以0.1%蛋白胨水溶液約10 mL溶解，導入集菌過濾器內，采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液600 mL沖洗濾膜，最后1次沖洗過程在濾膜內留少量溶液，加入1 mol/L MgSO4溶液4 mL，作用20 min，最后在培養管內加入100 mL適宜培養基進行無菌檢查，并以大腸埃希菌為陽性對照菌。

表2 注射用甲磺酸左氧氟沙星無菌方法適用性試驗結果

3 討論

無菌檢查是有關藥品安全性的一種定性試驗[3-4]。無菌檢查法是針對無菌工藝產品和最終滅菌產品的無菌性而建立的檢驗法，藥典要求，無菌藥品包括各類注射用制劑、眼科用制劑及用于手術、嚴重燒傷、嚴重創傷等的產品。即進入人體血液循環系統、植入或埋入肌肉、皮下組織、與創傷部位接觸的產品、材料、器械及醫學使用上要求無菌的品種，均可按本方法進行無菌檢查[5]。注射用甲磺酸左氧氟沙星直接進入人體血液循環，故應對其進行無菌檢查，以確保用藥安全。

無菌檢查法主要包括薄膜過濾法和直接接種法[6]。薄膜過濾法將規定量的供試品或供試液通過薄膜過濾處理，使產品中可能存在的微生物被截留于濾膜上，然后接種于適宜的培養基，使濾膜上截留的微生物得以生長繁殖到肉眼能觀察到的狀態而被檢出[7]；有抑菌性的供試品經薄膜過濾后，用適量的沖洗液沖洗濾膜，充分消除殘留的抑菌成分，使濾膜上阻留的微生物得以生長繁殖到肉眼能觀察到的狀態而被檢出[8]。直接接種法將規定量供試品直接接種到適宜的培養基中培養，使供試品中可能存在的微生物得以生長繁殖到肉眼能觀察到的狀態而被檢出[9]。薄膜過濾法可以檢測更大的樣品量，以保證所得結果更有統計學意義，對于具有抑菌性的供試品還可通過加大沖洗量去除樣品的抑菌成分，是藥品首選的無菌檢測方法。直接接種法可彌補無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。

本研究中采用薄膜過濾法及薄膜過濾結合中和劑法開展無菌方法適用性研究，結果表明，注射用甲磺酸左氧氟沙星的抑菌性對大腸埃希菌很強，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌較強，對白色念珠菌和黑曲霉較弱。在微生物無菌方法適用性研究中，金黃色葡萄球菌代表革蘭陽性菌，大腸埃希菌代表革蘭陰性菌，枯草芽孢桿菌代表芽孢桿菌，生孢梭菌代表厭氧菌，白色念珠菌代表酵母菌，黑曲霉代表霉菌[2]。本研究結果顯示，喹諾酮類抗菌藥物對革蘭陰性菌表現出很強的抑菌性，對革蘭陽性菌、芽孢桿菌和厭氧菌的抑菌性稍遜，對霉菌和酵母菌的抑菌性較弱。

中和劑或滅活劑可用于消除供試品干擾物的抑菌活性。對于抑菌性較強的藥品可通過添加中和劑或滅活劑消除其抑菌性。聚山梨酯80為非離子表面活性劑，作為助溶劑和中和劑被廣泛應用于藥物無菌檢查試驗。聚山梨酯80常被添加在沖洗液或培養基中，使藥品充分溶解并有效中和其抑菌成分，從而降低藥品的抑菌性[10-11]。本研究在沖洗液中添加體積分數為5%的聚山梨酯80（若添加更高體積分數的聚山梨酯80，在沖洗過程會產生大量泡沫而影響結果觀察[12]）作為沖洗液，沖洗量增至

每膜600 mL時，仍未能有效中和、去除注射用甲磺酸左氧氟沙星對細菌的抑菌性。喹諾酮類抗菌藥物能螯合細菌所需的鎂離子、鈣離子等金屬元素，故在最后少許沖洗液中加入MgSO4，并作用20 min，結果有效中和、去除了該藥品的抑菌性[13]。

綜上所述，MgSO4較聚山梨酯80更能有效中和、去除甲磺酸左氧氟沙星對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的抑菌性，更適合用作喹諾酮類抗菌藥物的抑菌劑和中和劑，在無菌檢查過程消除藥品的抑菌性。