大豆磷脂酰膽堿細菌內毒素檢查方法考察

肖婧薇，王文佳，何華紅，李 薇

（廣東省廣州市藥品檢驗所醫療器械及藥包材<藥理>室，廣東 廣州 510610）

大豆磷脂酰膽堿是大豆磷脂的主要活性成分，大豆磷脂作為天然乳化劑、增溶劑、分散劑廣泛應用于藥物注射劑中[1-2]，故大豆磷脂酰膽堿也是一種用于注射劑的藥用輔料。注射劑直接注入人體，其細菌內毒素的含量或限值有嚴格規定，所用輔料也必須符合相應規定。2015年版《中國藥典》尚未將大豆磷脂酰膽堿作為藥用輔料收載，本研究中參照2015年版《中國藥典（四部）》通則1143[3]154-157“細菌內毒素檢查法”，全面考察了大豆磷脂酰膽堿的細菌內毒素檢查方法，以進一步控制注射劑質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：TW12型六孔恒溫水浴（德國Julabo公司）；MS3basic型旋渦混合器（德國IKA公司）；LKL164-03型內毒素定量儀（英國Lab Kinetics公司）；2-16KL型低溫高速離心機（德國Sigma公司）。

試藥：大豆磷脂酰膽堿（德國Lipoid GmbH，批號為579010-1150055-13，579010-1160058-15，579010-1160059-05，規格為原料，含量為98%）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-201580，規格為每支80 EU）；細菌內毒素檢查用水（BET水，批號為1606290，規格為每支100 mL），鱟試劑 A（TAL，批號分別為 1606142，1607201，規格為每支0.1mL，靈敏度分別為0.25EU/mL和0.06EU/mL），鱟試劑 C（KCA，批號為1709140，規格為每支1.25 mL，靈敏度為50～0.005 EU/mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；鱟試劑B（TAL，福州新北生物有限公司，規格為每支 0.1 mL，批號分別為 16031712，16020712，靈敏度分別為0.25 EU/mL和0.06 EU/mL）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值

各國藥典均未收載該品種，而在廠家所附標準中，細菌內毒素限值為每1 g大豆磷脂酰膽堿含內毒素的量應小于6 EU。該品種是大豆磷脂的主要活性成分，其在藥物制劑中的功能和用途與大豆磷脂相似，2015年版《中國藥典（四部）》收載的大豆磷脂（供注射用）[3]468-470的細菌內毒素限值為每1 g大豆磷脂含內毒素的量應小于2.0 EU。綜合考慮，本研究限值確定為2.0 EU/g。

2.2 細菌內毒素含量檢測（凝膠法）

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143“細菌內毒素檢查法”進行鱟試劑標示靈敏度（λ）復核。結果4批鱟試劑λc為0.5～2.0 λ，符合進行細菌內毒素檢查的規定。詳見表1。

表1 TAL靈敏度復核試驗結果(凝膠法)

2.2.2 干擾預試驗

最小質量濃度計算：最小有效稀釋濃度C=λ/L，L=2.0 EU/g。目前用于藥品檢驗的市售鱟試劑靈敏度一般為0.25～0.03 EU/mL，因此相對應的最小有效質量濃度為 125.00，62.50，31.25，15.62 g/L。

溶液制備：取3批樣品，用BET用水溶解制成質量濃度為125 g/L的供試品溶液，置旋渦振蕩器振蕩5 min使充分混勻，再稀釋成3個質量濃度梯度的系列溶液，標記為供試品管（NPC系列）；取NPC系列溶液，加入細菌內毒素，制得每個稀釋度中含2 λ細菌內毒素的供試品溶液，標記為供試品陽性對照管（PPC系列）。

操作步驟：取靈敏度為0.25 EU/mL的2個不同廠家的TAL，每個質量濃度的NPC和PPC各做2管，同時做細菌內毒素陽性對照（PC）和BET用水陰性對照（NC）各2管。結果3批樣品質量濃度在62.5 g/L及以下時對2個廠家鱟試劑與細菌內毒素的反應均無干擾作用。詳見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果(凝膠法)

2.2.3 正式干擾試驗

取3批樣品適量，分別用BET用水制成質量濃度為 62.5 g/L 的溶液，并制成含 2 λ，1 λ，0.5 λ，0.25 λ細菌內毒素的供試品溶液，取靈敏度為0.25 EU/mL的2個廠家的鱟試劑，按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143中的“干擾試驗”項下方法試驗。以BET用水進行對照。結果內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值（Es）和供試品溶液反應終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5 λ～2.0 λ范圍內，3批樣品質量濃度為62.5 g/L時對2個廠家鱟試劑與細菌內毒素的反應均無增強或抑制的干擾作用。故大豆磷脂酰膽堿（94%）的最大不干擾質量濃度為62.5 g/L。詳見表3。

表3 樣品干擾試驗結果(凝膠法)

2.2.4 樣品細菌內毒素檢查

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143中的“細菌內毒素檢查法”，用靈敏度為0.06 EU/mL的鱟試劑分別對3批樣品進行細菌內毒素檢查，結果3批樣品的細菌內毒素檢查結果均符合規定。詳見表4。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果(凝膠法)

2.3 細菌內毒素含量檢測（顯色基質法）

2.3.1 標準曲線的可靠性試驗

取1支細菌內毒素工作標準品，加入1 mL BET用水溶解，再稀釋成濃度分別為 10，1，0.1，0.01 EU/mL的系列溶液，各取0.1 mL，分別與0.1 mL鱟試劑混勻，每個濃度平行做3支管，置內毒素定量儀中，在（37±1）℃下進行檢測。以BET用水作陰性對照。結果回歸方程為lgTg=2.881 3-0.308 0 lgC（r=-0.999 6），陰性對照的反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，各反應點平行管之間的變異系數（CV）均小于10%，表明標準曲線可靠，試驗方法成立。詳見表5。

表5 標準曲線可靠性試驗結果(顯色基質法)

2.3.2 干擾試驗

標準曲線最低點的濃度為0.01 EU/mL，故最小有效稀釋質量濃度為5 g/L。取3批樣品適量，用BET用水溶解成質量濃度為125 g/L的溶液，置旋渦振蕩器振蕩5 min，稀釋成質量濃度為 62.5，31.25，15.6 g/L的系列梯度溶液，作為供試品溶液（A液）；另外，制成含0.5 EU/mL細菌內毒素的供試品溶液（B液），充分振蕩，215×1g離心 5 min，立即取上清液，分別取0.1 mL與0.1 mL鱟試劑混勻，每個質量濃度平行做2支管，于內毒素定量儀中進行檢測。結果3批樣品質量濃度在62.5 g/L及以下時，細菌內毒素的回收率在50%～200%之間，表明樣品對動態顯色法下鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用。詳見表6。

表6 樣品干擾試驗結果(顯色基質法，n=2)

2.3.3 內毒素回收試驗

3批樣品各稱取4份，分別用含細菌內毒素0，0.1，0.2，0.4 EU/mL的BET用水溶解成質量濃度為110 g/L的溶液（每1 g大豆磷脂酰膽堿對應的內毒素含量為0，0.9，1.8，3.6 EU），充分振蕩 5 min，用 BET 用水稀釋1倍，振蕩均勻，215×1g離心5 min，立即取上清液進行檢測。結果3批大豆磷脂酰膽堿均未檢出細菌內毒素，內毒素加入量為0.05，0.10，0.20 EU/mL時的回收率均為75% ～112%，表明供試品溶液制備過程中的離心處理不會影響細菌內毒素的檢出。詳見表7。

3 討論

近年來，由于藥用輔料的問題導致的藥品嚴重不良反應或影響用藥安全的事件層出不窮[4-6]，究其原因主要為質量標準不完善、使用方法不規范[7]。2015年版《中國藥典》中藥用輔料標準收載量僅270種，其中供注射用藥用輔料23種，與美國藥典、歐洲藥典中1 000多種的收載量比相差較大，因此，藥用輔料質量標準的提高和完善迫在眉睫。大豆磷脂酰膽堿作為藥用輔料的新品種，其質量標準的研究和制訂更應受到重視。對注射劑常用藥用輔料應進行相應的安全性檢查，而細菌內毒素檢查是其安全性檢查中必不可少的一項[3]400-402。

表7 回收試驗結果(顯色基質法)

2015年版《中國藥典》收載的細菌內毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，供試品檢測時可使用其中任意一種方法，但當結果有爭議時凝膠法為仲裁方法[3]154-157，因此本研究中首先采用凝膠法考察大豆磷脂酰膽堿細菌內毒素檢查的可行性。結果表明，大豆磷脂酰膽堿質量濃度在62.5g/L及以下時對2個廠家生產的鱟試劑無干擾作用，但使用靈敏度為0.125～0.03 EU/mL的凝膠法鱟試劑對該品種的細菌內毒素進行定性檢查，且限值可定為2.0 EU/g。

細菌內毒素檢查法的光度測定法包括濁度法和顯色基質法，結果可準確反映細菌內毒素的含量，對生產過程和最終產品的質量控制意義重大。大豆磷脂酰膽堿不能完全溶于水，在本試驗濃度下，樣品與水只能形成混懸液。混懸液的反應體系對2.2項試驗反應并無影響，但對2.3項試驗中吸光度的檢測有一定影響，因此將供試品溶液離心，取上清液進行檢測。為了考察萃取處理是否會影響細菌內毒素的檢出，在配制供試品時添加細菌內毒素標準品進行外加內毒素回收試驗[3]154-157。在該情況下，一般會采取特殊方法來制備供試液，如增溶[8]、萃取[9-10]、過濾[11]等，再進行外加內毒素回收試驗，以考察處理方法是否會影響內毒素的檢出。本研究中，前期曾嘗試過加入乙醇以增加溶解性，但效果不佳，也曾嘗試過微膜濾過以去除混懸液中的顆粒，但極易堵塞濾頭。最后經試驗證實，采用振蕩混勻并離心取上清液的操作可行。但得到的供試液并非澄清透明，仍有輕度混濁，會影響濁度法中濁度的測定，而顯色基質法是通過測定呈色團的吸光度來反應內毒素的含量，因此不會影響檢測結果，可進一步進行干擾試驗和回收試驗。經考察，大豆磷脂酰膽堿在質量濃度62.5 g/L及以下時對試驗結果無干擾作用，且供試液制備過程中的萃取操作不會對供試品本底細菌內毒素造成影響，可采用動態顯色法鱟試劑對該品種進行細菌內毒素的定量檢測。

綜上所述，凝膠法與動態顯色法均可用于大豆磷脂酰膽堿的細菌內毒素檢查，本研究結果為該品種細菌內毒素檢查方法的制訂提供參考。但本試驗樣品量較少，要制訂相關質量標準還需更多批次的試驗數據加以驗證。